《蛋白诱导LJ》PPT课件.ppt

实验四实验四基因的诱导表达与融合蛋白的纯化基因的诱导表达与融合蛋白的纯化实验目的•掌握基因诱导表达的原理与方法掌握基因诱导表达的原理与方法•掌握蛋白质纯化的基本原理掌握蛋白质纯化的基本原理•巩固蛋白质电泳的基本方法巩固蛋白质电泳的基本方法基因工程的下游技术基因工程的下游技术基因的诱导表达和重组蛋白的纯化基因的诱导表达和重组蛋白的纯化一、基因表达系统一、基因表达系统表达载体表达载体(含有表达元件含有表达元件)IPTG诱导启动子载体诱导启动子载体(tac/trc/lac-pUC,pTZ,pSK,pBluescript,pGEM)表达宿主表达宿主T7噬菌体启动子载体噬菌体启动子载体(不依赖大肠杆菌不依赖大肠杆菌RNAP,T7-lac)PL启动子载体启动子载体(温度敏感温度敏感)原核原核(大肠杆菌大肠杆菌-物美价廉物美价廉、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)真核（酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞）真核（酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞）二、表达瓶颈二、表达瓶颈•1、蛋白翻译后、蛋白翻译后折叠折叠、、修饰修饰；；•2、蛋白翻译后、蛋白翻译后易降解易降解、形成、形成包涵体包涵体；；•3、蛋白、蛋白分离纯化分离纯化、复性；、复性；•4、基因表达调控。

基因表达调控三、表达方式三、表达方式•融合蛋白融合蛋白 1、、基因融合：将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连基因融合：将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，表达产物是一个接在一起，表达产物是一个杂和蛋白杂和蛋白，，靶蛋白靶蛋白连接在连接在运载运载蛋白（识别标签）蛋白（识别标签）的氨基端或羧基端的氨基端或羧基端 2、应用潜力：、应用潜力： 简化靶蛋白的标记与分离简化靶蛋白的标记与分离；； 靶蛋白与信号肽连接，将靶蛋白分泌到特定细胞区；靶蛋白与信号肽连接，将靶蛋白分泌到特定细胞区； 保护靶蛋白免受宿主蛋白酶降解；保护靶蛋白免受宿主蛋白酶降解； 改善靶蛋白溶解性，防止形成包含体改善靶蛋白溶解性，防止形成包含体•识别标签识别标签 β-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（lac-Z）） 谷胱甘肽谷胱甘肽-S-转移酶（转移酶（GST）） 多聚组氨酸（多聚组氨酸（poly-his）） 人工人工7肽肽FLAG人工标签人工标签选择表达载体常用的关键元件：选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。

子融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等如GST融合蛋白用融合蛋白用GST柱亲和层析柱亲和层析;多聚多聚His标签－标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化便于镍柱亲和层析纯化分泌信号分泌信号筛选标记筛选标记其它其它纯化条件宽松由于螯合作用不受纯化条件宽松由于螯合作用不受变性剂等因素的影响，故可在变性剂等因素的影响，故可在SDS或尿素等存在的条件下进或尿素等存在的条件下进行纯化，这对一些溶解度不佳的行纯化，这对一些溶解度不佳的重组蛋白的纯化尤其有利重组蛋白的纯化尤其有利四、表达体系选择四、表达体系选择•常用体系常用体系—大肠杆菌体系大肠杆菌体系（菌株（菌株+载体）载体） 依据：依据： 蛋白大小蛋白大小（（<100 amino acid residue）） 蛋白数量蛋白数量 蛋白活性要求蛋白活性要求（产生抗体、生物学研究、（产生抗体、生物学研究、 结构研究）结构研究）主要表达小的细胞因子和生长因子主要表达小的细胞因子和生长因子 五、实验流程：五、实验流程： 细菌细菌 亲和层析亲和层析IPTG诱导诱导细菌总蛋白细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析六、实验原理六、实验原理•重组蛋白的表达方式与纯化方式是由表达载体决定重组蛋白的表达方式与纯化方式是由表达载体决定的。

的•在原核表达系统，表达载体均携带一个在原核表达系统，表达载体均携带一个条件表达的条件表达的启动子启动子，由这一启动子控制外源基因的表达由这一启动子控制外源基因的表达•在未经诱导的情况下，外源基因不表达，这就防止在未经诱导的情况下，外源基因不表达，这就防止了外源基因产物对细菌正常生长的干扰在细菌生了外源基因产物对细菌正常生长的干扰在细菌生长达到一定数量时再加入诱导剂诱导基因表达，可长达到一定数量时再加入诱导剂诱导基因表达，可最大限度提高重组蛋白的产量最大限度提高重组蛋白的产量•重组蛋白的表达与诱导剂加入的重组蛋白的表达与诱导剂加入的时间和浓度相关时间和浓度相关七、本实验表达载体七、本实验表达载体pGEX系统系统含有含有启动子启动子(tac)及及Lac操纵基因、操纵基因、SD序列、序列、LacI阻遏蛋白阻遏蛋白基因等基因等调控序列调控序列SD序列下游就是序列下游就是GST基因基因，使克隆的，使克隆的外源基因与外源基因与GST基因相连表达产物为谷胱苷肽基因相连表达产物为谷胱苷肽-S-转移转移酶和外源蛋白的酶和外源蛋白的融合体融合体优点：优点：①①可诱导高效表达；可诱导高效表达；②②表达的融合蛋白质纯化方便；表达的融合蛋白质纯化方便；③③使用凝血酶和使用凝血酶和Xa因子就可从表达的融合蛋白中切下所因子就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽。

需要的蛋白质和多肽表达产物表达产物: GST-目的蛋白目的蛋白The structure of lac operon调节序列调节序列结构基因结构基因I阻遏因子阻遏因子Repressor and negative regulation异半乳糖异半乳糖异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异半乳糖异半乳糖•本实验采用的本实验采用的pGEX 4T-1表达载体，外源表达载体，外源基因与基因与GST形成形成GST-融合蛋白融合蛋白由于GST能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可利用偶联利用偶联谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和层析层析，纯化过程简便且产物纯度高纯化过程简便且产物纯度高八、影响外源蛋白表达的主要因素八、影响外源蛋白表达的主要因素•细胞细胞生长速率生长速率•细胞细胞生长温度生长温度（（20-37℃ ））•诱导剂诱导剂浓度浓度和诱导时间和诱导时间①①首先进行首先进行小规模预实验小规模预实验确定最佳条件确定最佳条件②②大规模培养大规模培养进行提取、纯化目的蛋白进行提取、纯化目的蛋白九、操作步骤九、操作步骤（一）融合蛋白的诱导表达（一）融合蛋白的诱导表达•1．接种．接种2个单菌落个单菌落（转化了（转化了空质粒空质粒pGEX-4T-1的的BL21菌种及携带菌种及携带112的菌种）于的菌种）于5ml LB Amp+液液体培养基，体培养基，37℃振荡振荡培养过夜培养过夜。

•2．将．将500µl过夜培养物与过夜培养物与50ml Amp+LB混合，混合，37℃振荡培养振荡培养4小时小时——放大培养放大培养•3．将培养物分成．将培养物分成8管，每管管，每管5ml，按下表所示加入，按下表所示加入IPTG，，30 ℃振荡培养振荡培养4小时小时序号序号加入的加入的100mM IPTG的体积（的体积（ ul ））IPTG终浓终浓度（度（mM））诱导时间诱导时间（小时）（小时）1（空质粒）（空质粒）--42（（112））--43（空质粒）（空质粒）250.544（（112））50.145（（112））250.546（（112））501.047（（112））1002.048（（112））2505.04•4. 每管菌液每管菌液3000rpm离心离心5分钟，收集沉淀，分钟，收集沉淀，弃上清•5. 每管各加入每管各加入200 μl 的上样缓冲液，振荡煮的上样缓冲液，振荡煮沸变性沸变性5分钟备用分钟备用 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，，简称简称Acr)和交联剂和交联剂N，，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称简称Bis)在加速剂和催化在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)。

优点：优点： (1)凝胶透明，有弹性，机械性能好凝胶透明，有弹性，机械性能好 (2)化学性能稳定化学性能稳定 (3)对对pH和温度变化较稳定和温度变化较稳定 (4)几乎无电渗作用，样品分离重复性好几乎无电渗作用，样品分离重复性好 (5)样品不易扩散，灵敏度可达样品不易扩散，灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节 (7)分辨率高分辨率高 PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分还可测定相对分子质量、等电点等子质量、等电点等 PAGE原理原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷 效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。

1.浓缩效应 (1)凝胶孔径的不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性2.分子筛效应3.电荷效应SDS-PAGESDS-PAGE原理原理SDS即十二烷基硫酸钠，是阴离子去污剂，和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物；SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开（二）（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳•1．安装电泳装置．安装电泳装置•2．配制．配制12% 分离胶分离胶10ml：： 4 0% Acr/Bis 3.0 ml 1.5 mol/L Tris pH 8.8 2.5 ml H2O 4.3 ml 10% SDS 0.1 ml 10% 过硫酸铵过硫酸铵 0.1 ml TEMED 0.004 ml 小心滴加小心滴加ddH2O覆盖于分离胶表面，静置覆盖于分离胶表面，静置 30min待凝胶凝结，弃去上层水。

待凝胶凝结，弃去上层水 3．配制．配制5%浓缩胶浓缩胶5ml：： 30%Acr/Bis 0.625 ml 1 mol/L Tris pH 6.8 0.63 ml H2O 3.6 ml 10% SDS 0.05 ml 10% 过硫酸铵过硫酸铵 0.05 ml TEMED 0.005 ml•4．电泳．电泳•(1)上样上样 20 ul •(2)电泳电泳 浓缩胶段：浓缩胶段：80 V/cm 分离胶段：分离胶段：120 V/cm•5．考马斯亮蓝染色：将电泳胶浸泡于考马斯亮蓝染色．考马斯亮蓝染色：将电泳胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，室温放置液中，室温放置10分钟。

分钟•6．脱色：将电泳胶从染色液中取出，浸泡于脱色液中，．脱色：将电泳胶从染色液中取出，浸泡于脱色液中，每隔每隔20分钟换一次脱色液三次后，脱色过夜分钟换一次脱色液三次后，脱色过夜7.结果观察结果观察8.选择最佳选择最佳生长温度、诱导浓度、诱导时间；生长温度、诱导浓度、诱导时间； 进行进行500ml大规模培养大规模培养—裂解细胞裂解细胞—纯化融合纯化融合蛋白蛋白—应用应用。