内质网应激在糖尿病肾损害中的作用机制研究.pdf

分类号：R587．1密级：单位代码：10422学号：200720695◎∥第办写博士学位论文ShandongUniversityDoctora|Dissertation论文题目：内质网应激在糖尿病肾损害中的作用机制研究MechanismsofEndoplasmicReticulumStressintheProgressofDiabeticKidneyInjury作者专业导师合作导师刘光辉内科学(心血管病)葛志明教授2010年4月10日原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人承担论文作者签名：壶苎垒歪日期：塑!兰!尘9关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。

保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：亟茎煎导师签名：矽f．6·；QEt期：——目录论文I内质网应激在糖尿病大鼠肾损害中的作用机制研究中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17日¨舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34仓U新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50局限性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50结j沧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59论文II血管紧张素II诱导系膜细胞凋亡的内质网应激通路研究中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯00000OBOe⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯76前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯000b000⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77刖青⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’7’7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯78结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯90讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨91创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯97局限性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯97结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯99参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯107攻读学位期间发表的文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯108学位论文评阅及答辩情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯109英文文章I⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111英文文章II⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯134CATALOGUEThesisI：EndoplasmicReticulumStressAssociatedApoptosisInvolvedintheKidneyInjuryofDiabeticRatsChineseabstract⋯⋯⋯．．⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯．．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1Englishabstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6Abbreviationdescription⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14Introduction．．．⋯⋯．．．．⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．⋯．⋯．⋯．⋯⋯⋯．⋯．．⋯⋯⋯⋯．．17Materialsands．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2()Results．．⋯．．．．．⋯⋯．⋯⋯．．．⋯⋯．⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯．．．⋯．．．⋯⋯⋯⋯．．．⋯3：!Discussion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34InnovativePoints．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．!；()Limitations．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5()Conclusions．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯5()Figures．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯!；1ofMesangialCellMightbeMediated⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．76⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．77．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．78Results⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯90Discussion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91InnovativePoints⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯97Limitations⋯．⋯．．⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯．．⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯97Conclusions⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98Figures⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯99References⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．103Acknowledgement．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．107PublishedArticles⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．．⋯⋯．．⋯．⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯108Commentsofthesis⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯109EnglishArticleI⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111EnglishArticleII⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯134山东大学博士学位论文论文一内质网应激在糖尿病大鼠肾损害中的作用机制研究博士研究生：刘光辉博士生导师：葛志明教授中文摘要研究背景糖尿病肾病(diabeticnephropathyDN)是糖尿病患者中最常见且危害最大的合并症之一。

众多的DN患者最终出现慢性肾功能不全，使得糖尿病成为目前全球终末期肾病(end—stagerenaldisease，ESRD)中最重要的原发病DN的病理和病理生理发展是一个缓慢且复杂的过程，但是目前有众多的实验研究证据支持过度的细胞凋亡是其中重要的发生机制细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下机体为维护内环境的稳定，通过有序的基因调控而诱导的细胞自杀细胞凋亡和细胞增生共同调节各部分细胞总量的平衡糖尿病状态下，促使细胞凋亡的诱导因素大大增多，使得凋亡的强度大于细胞增生，导致组织细胞数量减少，器官功能减退目前认为有三条通路参与凋亡的发生：线粒体通路，死亡受体通路和内质网通路内质网通路是新近研究发现的凋亡途径，其核心内容是内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)反应内质网在细胞中具有重要的功能，主要是参与膜／分泌性蛋白、氨基多糖、磷脂、胆固醇及钙信号等的代谢，特别是分泌性蛋白的合成与空间折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质分泌等当细胞内外的因素打破了蛋白质合成、成熟与降解之间的稳态，造成细胞内异常蛋白堆集，将诱发ERSERS通过未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)来适应细胞内外的应激，维持细胞的存活，主要的细胞反应包括暂时性中断细胞内总体蛋白合成、上调内质网分子伴侣和折叠酶的表达，诱导内质网相关性降解(ER-associateddegradation，ERAD)处理蓄积的蛋白分子等，但是如果应激因素持续存在或刺激过强时，细胞功能不能恢复时，内质网相关的细胞凋亡坐銮奎堂堡主堂垡丝奎(ER-associatedapoptosis)就会激活，受损细胞通过凋亡通路消亡，从而达到维护整体器官功能的目的。

但是如果凋亡的范围过大，速度过快，失去正常的调控，将导致组织细胞的大量丧失，同样导致器官功能严重减退肾脏细胞具有发达的内质网电镜扫描显示，肾小球的系膜细胞(mesangialcell)、肾小囊的足细胞(podoeyte)和肾小管的上皮细胞(tubularepithelialcell)的内质网结构丰富而复杂从细胞功能上讲，肾脏细胞与蛋白的合成、分泌和降解关系密切：系膜细胞合成基膜和系膜基质成分，吞噬和降解沉积在系膜上的免疫复合物，分泌肾素等生物活性物质；足细胞是肾脏滤过屏障的组成部分，细胞膜外联结有丰富的糖蛋白，其完整性直接影响肾小球的滤过功能；肾小管上皮细胞除了重吸收管腔内的蛋白质并将其代谢掉，还可分泌激肽释放酶等活性分子肾脏细胞的这些诸多功能很大程度上依赖于内质网来完成因此，从细胞的结构和功能分析，肾脏具有发生ERS的条件和基础从ERS激活的刺激因素来讲，糖尿病状态下可能的刺激因素大大增加，包括高血糖，氧化应激，蛋白尿以及细胞内外电解质紊乱等，但目前关于ERS与糖尿病肾损害的具体试验证据尚不充分因此，阐明糖尿病肾脏损害中ERS相关细胞凋亡的概况，明确触发凋亡的应激因素，了解凋亡通路的过程，从而对细胞凋亡做到适当的干预调节，挽救残存的肾脏细胞，对保护糖尿病患者的肾脏功能具有重要的积极意义。

研究目的1．构建糖尿病大鼠模型，验证糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡增加；2．明确内质网应激在糖尿病大鼠肾脏细胞中是否激活；3．明确内质网应激相关凋亡通路在糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡中的信号通路研究方法1．糖尿病大鼠模型的构建7周左右的雄性Wistar大鼠30只，体重280_+109随机分为2组：对照组10只，糖尿病组20只标准大鼠饲料适应性喂养1周后，禁食12h，糖尿病组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)65mg／kg(溶于pH4．5的柠檬酸盐缓冲液)，对照。