大肠杆菌感受态细胞及其制备课件.ppt

感受态的制备1大肠杆菌感受态细胞及其制备l什么是感受态细胞（Competent cell ）？ 细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞感受体细胞2大肠杆菌感受态细胞及其制备l作为感受态细胞应具备什么特点？•（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）*•（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）•（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏3大肠杆菌感受态细胞及其制备l感受态细胞可以用来做什么？•将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作4大肠杆菌感受态细胞及其制备l制备感受态的方法 化学方法化学方法 电击法电击法CaCl2 制备法制备法氯化锂制备法（毕氏酵母）氯化锂制备法（毕氏酵母）5大肠杆菌感受态细胞及其制备•电击法与CaCl2 制备法制备法的区别•原理： 电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。

CaCl2 法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42℃，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA6大肠杆菌感受态细胞及其制备其他： 做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高另外，需要专门的仪器 化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广下面详细介绍CaCl2制备法7大肠杆菌感受态细胞及其制备•CaCl2制备法•原理 在CaCl2溶液中，细胞会发生膨胀，Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞8大肠杆菌感受态细胞及其制备•仪器及设备 高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等•培养基及试剂 液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mM CaCl2 溶液（含15%甘油）9大肠杆菌感受态细胞及其制备•准备工作•所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用•洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）•离心杯、EP管灭菌后置于-20℃预冷备用。

•自封袋写上感受态名称、批号10大肠杆菌感受态细胞及其制备•划板•从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存在划线板上做好相应标记，于37℃培养16-20小时11大肠杆菌感受态细胞及其制备•接种•在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20μl枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有LB的试管中，将试管置于37℃恒温摇床培养10-12小时12大肠杆菌感受态细胞及其制备•转接•将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中一般转接菌液与培养基体积比例不得大于１:１０，即转接菌液:培养基体积≦ １:１０ 培养基体积与三角瓶体积比不得小于１:５，即 培养基体积:三角瓶体积≧ １:５ 要有足够的空间提供溶氧13大肠杆菌感受态细胞及其制备 转接完成后，置于37℃，220r/min培养1小时左右检测OD600值，一般OD600值不要超过0.6，也不要低于0.2 ODOD值值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长同时， OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。

不同的菌种所对应的值不一样•注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作14大肠杆菌感受态细胞及其制备•离心•操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤都需快速在冰上操作，并严防污染！都需快速在冰上操作，并严防污染！1.将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于-20℃预冷的离心杯中将装有菌液的离心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷却15大肠杆菌感受态细胞及其制备2.取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4℃，离心15min此时可以将CaCl2 溶液放入-20℃预冷（ CaCl2 溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的CaCl2 溶液最好弃去）不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改16大肠杆菌感受态细胞及其制备3.离心结束后，小心倒去上清，加入0.2倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液充分悬浮细胞4.配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4℃，离心15min，充分除去上清，加入0.05倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液充分悬浮细胞冰浴30min17大肠杆菌感受态细胞及其制备•分装•在冰上将定容好的细胞以50μl/支分装到预冷的EP管中，将EP管插入冰中。

分装完成后装入对应的自封袋，立即放入-80℃备用18大肠杆菌感受态细胞及其制备•检测（转化）•转化的原理 溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中19大肠杆菌感受态细胞及其制备20大肠杆菌感受态细胞及其制备•另设一组阴阳性对照 阴性对照：即不转入任何质粒，热击后涂 Amp平板 阳性对照：即不转入任何质粒，热击后涂无抗板待平板表面菌液被吸收，倒置于37℃过夜培养21大肠杆菌感受态细胞及其制备•检测结果评判•正常情况：转入质粒的平板和阳性对照长菌，阴性对照不长菌•若阳性对照不长菌，说明细胞已经死亡；阴性对照长菌，说明已经被污染应弃去整批感受态•若对照组正常，转入质粒的平板不长菌，应重新再做转化，设如同前一次的对照组22大肠杆菌感受态细胞及其制备。