（新编）化合物结构鉴定.doc

3.4 Fusarium sp. JN158 紫色素的分离纯化3.4.1 利用 LC/MS 对紫色素组分的分析A BC图 3-11 紫色素溶液的 HPLC(A)和总离子流色谱图(B)及各组分的 MS 正离子图(C)Fig. 3-11HPLC (A), total ion chromatography (B) and MS spectra of purple pigmentLC/MS 技术是将液相色谱高效的分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力相结合，并且同时能得到化合物的保留时间、分子量与特征结构碎片等丰富信息，是组分复杂样品及微量样品分离分析最有力的研究方法 [69]该紫色素的 LC/MS 色谱图如图 3-11 所示由图可看出该色素有 6 个主要峰，分析时间大概是 15 min，这些主要峰基本达到基线分离，分离峰窄而高、峰形尖锐、无漂移对出峰时间分别为2.67、3.14、3.64、3.74、4.18、5.36 min 的化合物进行质谱扫描，然后通过Massly-nx V4.1 软件进行分析，得到这 6 种组分的分子量分别为354.0、368.0、368.0、382.0、368.0、382.0，发现这 6 种化合物的分子量之间平均相差 14，其中 3 种分子量为 368.0、2 种分子量为 382.0 的应该是结构类似物。

3.4.2 利用 HPLC 对紫色素进行分离本实验通过 HPLC 分离各组分图谱如图 3-12 所示图 3-12 紫色素各组分的 HPLC 洗脱图谱Fig. 3-12 Spectrum of the composition of the purple pigments by HPLC本实验选用 C18 柱，对色素分离效果较好，由图可看出有 6 个峰，与 LC/MS分析的出峰数基本上一致，分别标记成Ⅰ～Ⅵ，Ⅵ峰的峰相对最高，与周围杂峰距离也较远，该组分较易分离纯化，所以只对这一组分进行了制备3.4.3 利用 HPLC 对色素样品进行纯度检测将收集到的色素溶液集中，加 NaOH 沉淀，得到紫色的色素，用乙腈-三氟乙酸溶解后，用 C18(4.6×250 mm)的分析柱对纯化后的色素进行纯度检验，结果如图 3-13 所示图 3-13 检测色素纯度的 HPLC 图谱Fig. 3-13 Spectrum of detecting the pigment purity by HPLC由图可看出，收集的色素Ⅵ的纯度能达到 95%以上，纯度满足要求3.6 Fusarium sp. JN158 紫色素结构的鉴定3.6.1 紫色素的紫外光谱分析图 3-21 紫色素的光谱扫描图Fig. 3-21The spectrum of purple pigment早期对有色的有机化合物研究发现，颜色的发生与分子中存在不饱和基团或体系有关如> C=CC=O， -N=N-， 苯 环 等 ， 把 这 些 基 团 或 体 系 称 为 生 色 团[72, 73]。

紫外光谱仅提供分子中的共轭体系和某些基团的结构信息通过LC/MS 的分析，得到该色素的紫外吸收光谱如图 3-21由图可看出，该化合物在紫外区有两条吸收带，分别为 253 nm 和 274 nm，可初步判断该色素是一种带苯环的化合物3.6.2 紫色素的质谱分析一级质谱主要是用于分析目标分子的分子量，该紫色素的一级质谱图如图3-22 所示，从图可看出该色素的分子量为 382.0m/z40608010120%010a 94 (6.94) 1: TOF MS E+ 23438384384 7650图 3-22 紫色素的正离子质谱图Fig. 3-22The MS spectra of purple pigment3.6.3 紫色素的红外光谱分析*素素素56.5279.43102.081048.05147.06126.7134.601382.61431.031453.821596.421616.091732.972926.23437.2936 3840 4244 4648 5052 5456 5860 6264 6668%T500 1000 1500 2000 3000 4000 Wavenumbers (cm-1)图 3-23 紫色素的红外光谱图Fig. 3-23 The IR spectrum of purple pigment红外光谱是记录有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的光谱吸收，测定范围一般为 4000～400 cm-1，常用来确定各种 羧基、烷烃、芳环及炔烃等基团的特征吸收峰。

基团频率区在 4000～1300 cm-1 之间，在 1800 cm-1(1300cm-1)～600 cm-1 区域内，除单键的伸缩振动外，还有因变形振动产生的谱带O-H基的伸缩振动出现在 3650～3200 cm-1 范围内；-CH 2 基的吸收峰出现在 2930 cm-1 和 2850 cm-1 附近；C=O 伸缩振动出现在 1900～1650 cm-1 范围内；苯的衍生物的泛频谱带，出现在 2000～1650 cm-1 范围，是 C-H 面外和 C=C 面内变形振动的泛频吸收；频率范围在 1500～1300 cm-1 为 C-H 弯曲振动区；酚的相应谱带在较高频率 1200～1280 cm-1；醇的 C-O 出现在 1000～1200 cm-1[72-74]结合图 3-23，该紫色素的红外光谱分析结果汇总见表 3-7表 3-7 紫色素的红外光谱分析结果Table 3-7 The IR spectrum results of purple pigment红外吸收(cm -1) 官能团 结构特征3437, 1226 酚羟基 O-H 伸缩振动2926,1453, 1431 CH3,CH2 C-H 反对称弯曲振动1732, 1616, 1596 芳环 C=C 伸缩振动1147, 1048, 1002 C-O C-O 伸缩振动3.6.4 紫色素的核磁共振(NMR)分析1) 1H 核磁共振图谱( 见附录 2)分析从图谱的位移值及峰形来看，化学位移 11.500 为烯醇的 H；化学位移5.384 与芳环中的羟基中的 H 一致；化学位移 3.908 为醇羟基中的 H；化学位移4.550 为甲氧基相连的 CH2 中的 H；化学位移 4.053 与羟基相连的 CH2 的 H 一致；化学位移 4.486 为 C=C-OCH3 中的 H；化学位移 3.527 为 C-C-OCH3 中的H。

2) 13C 核磁共振图谱(见附录 2)分析从图谱的位移值及峰形来看，化学位移 178.67、176.12 与羧基中的 C 一致；化学位移 53.12、53.71、55.68 为甲氧基中的 C，表明该色素含有 3 个甲氧基，其中 2 个是对位的，与氢谱结果一致；化学位移 157.42 为苯环中与羟基相连的C；化学位移为 C=C 中接羟基的碳；化学位移 56.27 与 C-OH 中的 C 一致结合紫色素的性质及质谱与红外的光谱分析，通过 COSY(Correlated Spectroscopy)、HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherece)、ROESY(Rotaing Frame Overhauser Efect Spectroscopy)及 MLEV[M. Levitt (broadband composite decoupling sequence )]对 1H、 13C 核磁共振谱峰进行准确的归属 [75, 76]，确定了该色素的分子量为 382.0，分子式为 C17H18O10，结构如下图：OOH3COHOOHOHOCH3OOHOC3。