α-硫辛酸与维生素C对2型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究.pdf

广州医学院硕士学位论文α-硫辛酸与维生素C对2型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子 影响的比较研究姓名：刘枘岢申请学位级别：硕士专业：内分泌指导教师：李万根20100501广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 2 - α-硫辛酸与维生素C对2型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究α-硫辛酸与维生素C对2型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 硕士研究生：刘枘岢 导 师：李万根 主任医师 广州医学院第二附属医院内分泌科 中文摘要中文摘要 目的目的 1.观察短期胰岛素强化降糖治疗后， 2 型糖尿病患者血清总 SOD 活力、 MDA含量和 ICAM-1 水平、hsCRP 水平的变化2.探讨α-硫辛酸、维生素 C 对强化降糖治疗的 2 型糖尿病患者氧化应激水平及内皮细胞功能的影响 方法方法 2 型糖尿病患者接受治疗前检测血清总 SOD 活性、MDA 含量及 ICAM-1 水平、hsCRP 水平，予以 7 天胰岛素强化降糖治疗后对上述指标进行检测，并分为三组：⑴ α-硫辛酸组，继续胰岛素强化降糖治疗并加予 α-硫辛酸干预治疗 7 天后复测上述指标；⑵ 维生素 C 组，继续胰岛素强化降糖治疗并加予维生素 C 干预治疗 7天后复测上述指标；⑶ 对照组，继续胰岛素强化降糖治疗 7 天后复测上述指标。

采用分光光度法检测并计算出总 SOD 活性、MDA 含量；酶联免疫吸附法测定 ICAM-1水平、hsCRP 水平 结果结果 1. α-硫辛酸组、维生素 C 组接受胰岛素强化降糖治疗前，血清总 SOD 活性、MDA 含量及 ICAM-1 水平、 hsCRP 水平无显著性差异 2. 33 例患者接受胰岛素强化降糖治疗 7d 后， 血清总 SOD 活性明显升高 （P45IU/L、Cr>126µmol/L） ； ⑷感染（如呼吸道感染、消化道感染、泌尿系感染、皮肤感染等） 2、 研究内容 2.1 研究药物 甘精胰岛素（商品名来得时）300U/支（赛诺菲安万特公司） ，门冬胰岛素（商品名诺和锐）300U/支（诺和诺德公司） ，维生素 C 片 100mg/片（广东华南药业集团有限公司） ，α-硫辛酸注射液 20ml：0.6g（上海现代哈森药业有限公司） 2.2 实验分组 患者接受 7 天胰岛素强化降糖治疗后，分为三组：⑴α-硫辛酸组(α-硫辛酸0d)，继续胰岛素强化降糖治疗并加予 α-硫辛酸干预治疗 7 天(α-硫辛酸7d)； ⑵维生素 C 组(维生素 C0d)，继续胰岛素强化降糖治疗并加予维生素 C 干预治疗 7 天(维生素 C7d)；⑶对照组(对照组0d)，继续胰岛素强化降糖治疗 7 天(对照组7d)。

2.3 研究步骤 研究对象测量血压、身高、体重空腹 8 小时于次日清晨抽取肘静脉血测血糖、HbA1c、甘油 三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等生化指标 广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 11 - 2.4 治疗方法 2.4.1 强化降糖方式 ⑴CSII 方式：采用美敦力胰岛素泵（712 型，美国美敦力公司生产）进行皮下持续输入门冬胰岛素治疗（丹麦诺和诺德公司生产速效胰岛素诺和锐，300U/支） ；⑵MSII 方式：采用门冬胰岛素（诺和锐，300U/支） 、甘精胰岛素（赛诺菲安万特公司生产长效胰岛素来得时，300U/支） 用胰岛素笔分别于三餐前及晚餐前皮下注射治疗各患者根据经济情况选取以上两种强化降糖治疗方式 2.4.2 血糖监测 由内分泌科专科护士按规范化操作测定指尖末梢血血糖，每天监测空腹、三餐后和睡前共五次血糖，必要时加测午、晚餐前及凌晨血糖。

2.4.3 胰岛素剂量 根据患者的血糖水平、体重指数，按初始剂量 0.4U—0.6U/Kg 确定每日所需胰 岛素总量， CSII降糖方式总剂量的50%为基础量， 其余50%为餐前追加量大致按4:3:3另取 5ml 空腹静脉血 3500 转/分速度下离心 10 分钟分离血清-70℃低温冰箱保存待测，测定 SOD、MDA、hs-CRP、ICAM-1 胰岛素强化治疗 7 天α-硫辛酸组 (α-硫辛酸0d)维生素 C 组 (维生素 C0d)对照组 (对照组0d)复测上述指标 (α-硫辛酸7d) 复测上述指标 (维生素 C7d) 复测上述指标 (对照组7d) 复测上述指标统计结果广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 12 - 的比例分别于早、中、晚餐前 15 分钟注射MSII 降糖方式总剂量的 50%为来得时用量，于晚餐前皮下注射，其余 50%为诺和锐剂量，大致按 4:3:3 的比例分别于早、中、晚餐前 15 分钟皮下注射根据每日血糖监测结果调整胰岛素剂量，开始降糖治疗后 5~7 天内血糖控制达标，血糖控制标准为空腹、三餐前血糖控制在 4~7mmol/L，三餐后血糖控制在 4~10mmol/L。

2.4.4 抗氧化剂治疗 α-硫辛酸组胰岛素强化降糖治疗 7 天后， 予以 α-硫辛酸注射液 600mg ivdrip Qd，治疗时间 7 天； 维生素 C 组胰岛素强化降糖治疗 7 天后， 予以维生素 C 片 300mg Tid，治疗时间 7 天 2.5. 资料收集与检测方法 2.5.1 病史采集 通过问诊、体格检查收集患者的一般情况，详细询问患者的高血压病史，询问患者的冠心病、脑血管意外等病史 2.5.2 物理检查 身高：被测者站立，脊柱伸直，足跟并拢，足尖分开，双眼平时前方，足跟、小腿、臀部靠于墙面，用直角三角板的一角边靠墙，另一角边与头顶相切，记下两直角边交点对应的米尺读数，精确至 1cm 体重：以清晨空腹、排尿后、去外套并扣除鞋帽重量测量为准，精确至 0.1kg BMI：由公式 BMI=体重(kg)/身高2(m2)求得 血压：上午 10 点安静环境下取坐位，以标准水银血压计、袖带加压法测定 2.5.3 生化指标测定 ⑴血糖：葡萄糖氧化酶法，采血后由广医二院检验科测定(批内差异<5%，批间差异<10%) ⑵糖化血红蛋白：放免法，采血后由广医二院核医学科测定(批内差异<5%,批间差异<10%） 。

⑶甘油三酯：酶法(CHOD-PAP 法)，采血后由广医二院检验科用日立 7600 全自动生化分析仪测定批内差异<5%,批间差异<10%） ⑷总胆固醇：酶法(GPD-PAP 法) ，采血后由广医二院检验科用日立 7600 全自广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 13 - 动生化分析仪测定批内差异<5%,批间差异<10%） 2.5.4 氧化应激指标的测定 标本收集完毕后统一测定， SOD 的测定采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法),MDA 的测定采用硫代巴比妥酸比色法(TBA),所有试剂盒均购自南京凯基生物公司(批内差异<6%,批间差异<10%)，操作过程按照试剂盒说明书进行，具体如下： ①总 SOD 活性的测定 实验用品： 总 SOD 测定试剂 A~F、显色剂、蒸馏水、玻璃比色杯、漩涡混匀器、分光光度计、恒温水浴箱、加样枪、小试管 实验步骤： ⑴ 加样反应： 试剂 测定管 对照管 试剂 A（ml） 1.0 1.0 样品（血清） （µl） 100 蒸馏水（µl） 100 试剂 B（ml） 0.1 0.1 试剂 C（ml） 0.1 0.1 试剂 D（ml） 0.1 0.1 用漩涡混匀器充分混匀，置 37℃恒温水浴 40 分钟 显色剂（ml） 2.0 2.0 ⑵ 测定读数： 混匀上述试剂，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色。

⑶ 总 SOD 活性计算： 对照管吸光度﹣测定管吸光度 对照管吸光度 对照管吸光度 A：反应体系的稀释倍数 B：样本测试前的稀释倍数 总 SOD 活性（U/ml）= ÷50%×A×B广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 14 - ② MDA 含量的测定 实验用品：试剂 A~C、标准品、显色剂、蒸馏水、玻璃比色杯、漩涡混匀器、分光光度计、恒温水浴箱、加样枪、小试管 实验步骤： ⑴ 加样反应： 标准管 标准空白管测定管 测定空白管*10nmol/ml 标准品（ml） a* 无水乙醇（ml） a* 测试样品（血清） （ml） a* a* 试剂 A（ml） a* a* a* a* 混匀（摇动几下试管架） 试剂 B（ml） 3 3 3 3 试剂 C（ml） 1 1 1 50%冰醋酸（ml） 1 漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后 3500~400 转/分，离心 10 分钟 a* 表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇量、试剂一量均相等。

* 一般情况下，标准管、标准空白管及测定空白管每批只需做 1~2 支，若测定管中蛋白量不是太高，则测定管可以不测，用标准空白管来代替测定空白管 ⑵测定读数： 取上清，532nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾斜，以免沉淀进入比色皿，影响吸光度 测定管吸光度－测定空白管吸光度 标准管吸光度－标准空白管吸光度 2.5.5 内皮功能指标的测定 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA 法)测定 hs-CRP、ICAM-1，严格按照试剂说明书操作，具体如下： ①hsCRP 含量的测定 MDA含量 （nmol/ml）=×标准品浓度（10nmol/ml） 广州医学院硕士论文 α-α- 硫辛酸与维生素 C 对 2 型糖尿病患者氧化应激水平及炎症因子影响的比较研究 - 15 - 试剂盒组成： 酶标板 96 孔 酶标抗体工作液 12ml 10×标本稀释液 12ml 20×浓缩洗涤液 50ml 标准品：800ng/瓶 2 瓶 底物工作液 12ml 第一抗体工作液 12ml 终止液 12ml 实验步骤： ⑴10×标本稀释液用蒸馏水作 1:10 稀释，洗涤液用双蒸水作 1:20 稀释。

⑵标本的稀释：取 10µl 血清，加标本稀释液 990µl,稀释 100 倍 ⑶建立标准曲线：使用前加入 2ml 蒸馏水混匀，配成 400ng/ml 的溶液设标准管 8 管，第一管加入标本稀释液 900µl,第二至第八管加入标本稀释液 500µl第一孔加入标准品 100µl,混匀后用加样器吸出 500µl，移至第二管，如此反复倍比稀释，从第七管中吸出 500µl 弃去，第八管为空白对照 ⑷加样：待测品孔中每孔加入稀释的待测样品 100µl ⑸充分混匀后置 37℃、120min ⑹洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4~6 次，向滤纸上印干 ⑺每孔加入第一抗体工作液 100µl，将反应板充分混匀后置 37℃、60min ⑻洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4~6 次，向滤纸上印干 ⑼每孔加酶标抗体工作液 100µl，将反应板置 37℃、60min ⑽洗板：同前 ⑾每孔加入底物工作液 100µl，置 37℃暗处反应 15min ⑿每孔加入 100µl 终止液混匀 ⒀30min 内用酶标仪在 450nm 处测吸光值 ⒁以标准品 40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、。