薄层色谱、柱色谱及凝胶色谱法+.ppt

薄层色谱、柱色谱及凝胶色谱法 金 敬 杰,色谱法概述,1 发展历史 俄国生物学家茨维特(T s w e t t)首先提出来的 1903年， T s w e t t柏林会议上宣读了他的研究成果 1906年，正式发表 样品：植物色素的石油醚提取液 柱： CaCO3(固定相） 洗脱剂： 纯石油醚（流动相） 结果： 有色谱带出现 实验方法：如图 （1-1） 所示：,,石油醚,,玻璃管,,CaCO3(粉末）,…,.….,…,::,…,…,……,……,…,图1 色谱,1919 T s w e t t逝世，当时他的方法并未引起注意 1931 R . k u h n（库恩）用该法成功分离了胡萝卜素和叶黄素 1938 R . k u h n Obtain Noble P rise. 1943 R . k u h n 发明了离子交换色谱 1944 英国的M a r t i n . J . P和S y n g e .R . L发明了纸色谱 1948 T i s e l I u s（瑞士）发明了电泳和 吸收分析 1952 英国的M a r t I n . J . P和S y n g e .R . L又发明了液相色谱。

1956 V a n . D e c e m t e r 提出了填充柱速率理论: H=A + B/u + Cu S t a h l 发明并完善了薄层色谱 F l o d i n发明了凝胶色谱 1958 G o l a y 发明了毛细管色谱； 氢火焰离子检测器 1969 K i r k l a n d 提出了表面孔度担体的新型填料 H e r m u n 研制成第一条高效液相色谱仪 1975 H . S m a l l 离子交换柱 1979 D . T. G j e r d e and J .S .F r i t z非抑柱的单柱离子色谱. 总之：1956 Van. D e e m t e r ：柱速率理论F l o d i n ：凝胶色谱理论Stahl：薄层色谱再加上1943年发明的离子交换色谱，使色谱学这门科学开始成为一门独立的学科2 基本原理： 色谱法是一种物理分离方法，即利用不同物质在两相(固定相和流动相)中具有不同的分配系数(或吸附 系数、渗透性等)，当两相作相对运动时，这些物质在二相中反复多次分配，从而使各物质得 到完全的分离 3 分类： ①按固定相和流动相的物态可分为：气相色谱法、液相色谱法; ②固定相的操作 方式及形状分类为：柱色谱、纸色谱、薄层色谱； ③以分离机制分 类为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色 谱（凝胶色谱）、亲和色谱,表1-1 色谱法的分类 流动相 气体 液体 固定相 液体 固体 液 体 固体 吸附剂 健合固 离子交换 凝胶 定相 树脂 固定相 外型 柱 柱 柱 平面 平面 柱 柱 柱 柱 气液 气固 液液 薄层 色谱 液固 健 合 离子交 凝胶 名称 色谱 色谱 色谱 纸 色谱 色谱 相色谱 换色谱 色谱 GSC LLC TCL LSC BPLC IC GPC PC,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GLC,1.3 几种分析方法比较 色谱 光谱 电化学 化学法 分离能力 强 弱 弱 一般 定性 弱 强 一般 强 定量 强 中 弱 中 一般 分析速度 快 快 较快 慢 分析范围 常量、微量 微量 常量、微量 常量 发射光谱 原子吸收光谱 Me、无机物 无机 分析对象 有机（无机） 吸收光谱、有机、 少部分有机物 （有机） 无机物大部分 特效性 一般 强 一般 弱,,,,Me 无机物,结论： 色谱法的分离效能是红外光谱、核磁和质谱所不及的,而且一般来说色谱法的灵敏度要比红外光谱高。

色谱法有一个非常大的弱点，就是在缺乏标准样品的,情况下定性比较困难而质谱法可以测定未知物的分子量,核磁可以测定分子结构，红外光谱法可以测定分子中的官能团，这是色谱法所不及的 以上看出，色谱定性困难（缺乏标样下），而 质谱 （MS ) 测未知物分子量 核磁 （NMR) 测分子结构 红外光谱（IR) 测分子中的官能团 色谱、质谱、光谱、联用，取长补短，发展迅速、发挥更大 的作用1 薄 层 色 谱,薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”1.1层析原理： 利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸附能力的差异从而达 到分离目的的方法 1.2 薄层层析的作用 （1）分离（0.5g以下） （5）确定组分数 （2）柱层析的先导 （6）定性鉴定 （3）其他分离手段的效果检测 （7）粗略比较含量 （4）监控反应,1.3 薄层层析的器材选择 1.3.1 基板：玻璃、塑料、金属箔 1.3.2吸附剂： （1）种类： 常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性） 不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳 （2）符号：H——无任何添加剂； G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂； F——加有荧光素（Fluorescein） CMC——加有羧甲基纤维素钠（3）粒度：颗粒的大小，表示方法有两种： 目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。

薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝 为200目， 硅胶为100~150目4）活性： 吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级, I级含水量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定 氧化铝的活化化I~V五级，I级的吸附作用太强，V级的吸附作用太弱所以一般常采用II，III级5）酸碱性： 市售氧化铝有酸性、中性、碱性，其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物大体分类如下： 碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱性化合物的分离 中性氧化铝应用最广，适用于醛、酮、醌以及酯类化合物的分离 酸性氧化铝适用于有机酸类的分离 硅胶没有酸碱性之分,,,,1.3.3 展开剂 主要考虑极性、溶解度、沸点等方面，极性大的样品应选用极性较大的展开剂溶解应适宜，沸点不宜太高 1.3.4 展开槽与展开 展开槽：卧式、立式、下行式,,,展开：卧式展开槽倾角15°； 展开剂用量：浸及下端硅胶，但不浸及样点点样端向下，每次只展开一 块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾斜）密闭展开，及时画出前沿线。

1.3.5 测量与计算： 1.3.6 显色： 普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、荧光素 用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等,1.4 操作要点和说明 薄层色谱法的整个过程包括以下步骤： 1.4.1 薄层板的制备 制薄层板的主要原料是吸附剂和粘结剂 吸附剂：最常用于 TLC的吸附剂为硅胶 GF254； 硅胶HF254 粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（CMC），也有用淀粉的CMC为粉状固 体，用时先加水，水浴上熬成糊状，配成1％水溶液 制板：小板的制备：将硅胶加 1％ CMC，调成浆状（在平铺玻璃上能晃动但 不能流动），将其涂在载玻片上（ 75 X 25）， 为使其平，可将载玻片 用手端平晃动，致坦平为止，放在干净平坦的台面上晾干之后放入110℃ 烘箱活化1小时即可使用（一次可做很多 块）图2 薄层板制备,1.4.2 点样 点样用的毛细管为内径＜ lmm的管口平整的毛细管，将样品溶于低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等）配成1％溶液 点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。

若在同一块板上点几个样，样品点间距离为5mm以上图3 点样,1.4.3展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂 的活性等因 素来考虑 薄层的展开在密闭的容器中进行先将选择的展开剂放入色谱器中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和5－10min，再将点好试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端 5－10mm）或多组分已明显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，即可显色图4 点样,1.4.4显色 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置图5显色,1.4.5用 TLC跟踪有机反应 在同一块板上点上原料样和反应混合物样（均需配成稀溶液），按上述方法进行展开和显色，记下原料样的斑点位置和反应混合物样中相应斑点的位置和大小过一定时间后，再取反应混合物样液点样、展开、显色，如发现反应混合液样中相应于原料斑点的位置处，无斑点或斑点变小，则说明反应已经完成或接近完成，所以依此可跟踪有机化学反应。

这在有机合成上很有意义2 柱 色 谱,柱色谱也叫柱层析分离,就是常说的过柱子柱色谱按分配原理不同分为吸附色谱和分配色谱两种吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂;分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相.我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱 2.1 吸附柱层析的原理： 混合样品在淋洗剂携带下流经吸附剂——反复多次的吸附-解吸溶解 过程——极性较大溶解度较小的组分在柱中走过较长的距离,出来的较晚.,2.2 柱色谱装置 柱色谱装置包括色谱柱、滴液漏斗、接受瓶 色谱柱有玻璃制的和有机玻璃制的，后者只用于水做展开剂的场合 色谱柱下端配有旋塞，色谱柱的长径比应不小于7-8:1图5 柱色谱,2.3 吸附柱层析的材料选择 2.3.1层析柱 材料：玻璃，塑料薄膜，不锈钢 尺寸：经长比1:8—1:50；最常用的约为1:15 细长：分离效果好，但时间长，分离量小，用于分离较难分离的样品 短粗：分离效果差，但可在较短时间内分离较多样品，用于较易分离或分离程度要求不高的样品 2.3.2 吸附剂 选择原则：大体同薄层层析，只是粒度略粗，一般氧化铝约150 目，硅胶约60—100目，不。