分子生物学实验基本技术.ppt

医学分子生物学实验 基本技术 金光辉、李炜、郑红花、宋刚、石松林、刘迎福章喻军、林筱Molecular Biology TimelineDNA discovered by F. Meischer18691910Genes on chromosomes; T.H. Morgan1941One gene-one enzyme, Beadle & Tatum1944DNA is genetic material; Avery, Mcleod& McCarty1953Structure of DNA; Watson, Crick, Franklin, Wilkins1961Discovery of mRNA; Brenner, Jacob & Meseleson1966Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana1972Recombinant DNA made in vitro; P. Berg1973DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. CohenDiscovery of reverse transcriptase; H. Temin19731977Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert1977Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al.1982Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman20011986Creation of PCR; K. Mullis et al.Human Genome Project; Venter, Collins and many others目的和要求通过分子生物学实验课程的学习和训练，1.1.掌握掌握该领域的基本知识、基本技能和基本方法;2.2.了解了解分子生物学这一新兴基础学科的研究发展、技术革新和最新成果;3.对分子生物学的研究领域、研究方法、临床应用等有完整的认识认识; 为今后从事科学研究和医学工作奠定基础。

Ø掌握实验操作中常用仪器仪器的使用和工作原理；学会研究中实验方法方法的选择、原理和操作；学会实验资料实验资料的收集、整理和；实验数据实验数据的处理；学会对实验结果实验结果的分析、整理和实验报告实验报告的正确书写；了解最新研究动向和技术Ø通过实验课程的学习加深对分子生物学理论知识理论知识的理解，提高科学思维能力思维能力和分析问题、动手解决问题的能力，培养严谨扎实的科研作风科研作风实验室规则1．实验前预习预习实验内容，熟悉实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注意事项2．遵守课堂纪律，实验中认真操作，保持室内安静安静3．保持实验室和仪器整齐清洁清洁实验工作结束后，要及时清扫地板和整理台面物品实验室严禁吸烟、随地吐痰、乱扔纸屑、杂物实验结束后值日生搞好实验室的卫生实验室清出的垃圾和试剂要分别倒（放）到指定的位置离开实验室前必须切断电源和关闭其他应关闭的仪器设备注意防火、防盗、防灾注意清除安全隐患，提高安全意识，注意关水、关灯、关电、锁门4．实验室有毒、易燃、易爆、腐蚀和贵重材料应谨慎操作操作、定点存放，领用要登记，使用要记录严格按照说明规范操作各种仪器和使用各种材料和试剂对于仪器、重要或危险物品的操作， 必须经他人指导、操作熟练后才允许独自操作。

对氢气等易燃气体和药品应远离火源5．实验室物品物品为实验专用，不得挪作它用或占为私有任何人未经批准，不得擅自将实验室的器材、药品等拿回宿舍使用或存放6. 爱护实验器材器材损坏实验物品按规定进行赔偿7．实验室内必须穿实验工作服实验工作服进行操作8．实验物品和试剂等使用后必须放回原来位置位置实验操作及实验报告要求一、实验操作要求一、实验操作要求1．实验课前预习实验内容，熟悉熟悉实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注意事项2．实验过程中严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验记录记录3．准确认真完整清楚记录记录实验现象、实验结果和数据实验记录需使用专用记录本，不可使用单片纸或草稿记录4．必须掌握操作步骤和实验流程后才能进行实验二、实验报告要求二、实验报告要求1．实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告实验报告要求语言准确精炼、表述流畅2．实验报告严格按照如下格式和内容书写 实验编号 实验名称 实验人、学号、实验组员、实验日期 实验目的 实验原理 实验材料 方法和步骤 实验结果 结果讨论和结论 实验思考题3．在写实验报告时，实验目的和原理应按照该次实验内容和实验步骤写出，要明确具体、有针对性。

实验材料包括实验所用的实验动物、细胞或组织、重要的实验试剂和仪器设备实验结果中应包括全部实验过程中观察到的现象、实验结果和实验数据实验数据中的图表要有图名和表名，图名位于图下方，表名位于表格上方图表需大小合适、标注清楚图表内容和所包含的信息必须在实验结果中使用流畅简洁语言表达出来结果讨论和结论是对实验过程、实验方法步骤的关键环节、实验设计的认识体会、实验结果、实验异常现象、实验思考题的分析和对该次实验作出的总结和结论 分子生物学实验进程实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR实验六 Western印迹（上）实验七 Western印迹（下）实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应实验十 Northern印迹实验十一 Southern印迹考试 生物技术生物技术（biotechnology): 基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程和酶工程，新生物技术的核心是基因工程技术。

新技术：基因操作技术、生物治疗技术、转基因动植物技术、人类和其他生命体基因组工程、基因治疗技术、蛋白质工程技术、生物信息技术、生物芯片技术等生物技术产业：生物技术产业：基因药物、重组疫苗、生物芯片、生物反应器、基因工程抗体、基因治疗与细胞治疗、组织工程、 转基因农作物、兽用生物制品、生物技术饲料、胚胎移植工程、基因工程微生物农药、环保、 海洋生物技术，以及现代生物技术对发酵、制药、轻工食品等传统产业的改造等领域生物技术在世界各国已经或正在成为新的产业生长点 基因工程技术上游技术（上游技术（upstream）——基因工程下游技术下游技术（downstream）——蛋白质工程上游技术（上游技术（upstream）——基因工程重组子的构建工程菌的构建及高效表达基因工程上游技术基本过程• 选择载体• 获得目的基因• 目的基因与载体的重组• 重组载体的转化• 重组子的筛选与鉴定基因工程技术下游技术下游技术（downstream）——蛋白质工程工程菌大规模发酵最佳参数的确定新型生物反应器的研制高效分离介质及装置的开发分离纯化的优化控制生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造超滤、反渗透技术的应用克隆（克隆（clone））:是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。

基因克隆（基因克隆（gene cloning））:指把一个生物体中的遗传信息（基因片段）通过无性繁殖转人另一个生物体内的过程通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也称其为DNA克隆基因克隆技术基因克隆技术: 包括基因的获取、基因的重组、基因的克隆化和基因的表达等DNA嵌合体（DNA chimera）：内、外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子（嵌合DNA）重组（ recombination）：构建DNA嵌合体分子（重组子）的过程基因重组（基因重组（gene recombination））:是将不同基因片段连接起来构成一个新的DNA分子的过程分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程基因工程基因工程（genetic engineering）、又称为DNA重组技 术（recombinant DNA technique）或分子克隆（molecular cloning）:特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术基因操作（gene manipulating）:指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术。

分子生物学实验基本技术•核酸纯化技术核酸纯化技术•离心分离技术离心分离技术•凝胶电泳技术凝胶电泳技术•核酸定量技术核酸定量技术•分子杂交技术分子杂交技术•序列分析技术序列分析技术•蛋白表达检测纯化技术蛋白表达检测纯化技术•………………一 、核酸纯化技术原 理 1. 核酸混合物成分: 结构类：细胞碎片、细胞器、其他 大分子：DNA、RNA、Protein、糖类、脂类等 小分子：氨基酸、小分子糖类和脂类、水、无机物等 2. 关键: DNA、RNA、Protein 3. 方案: Protein变性 苯酚：强变性 25 氯仿：弱变性 24 异戊醇：消泡分层 1方 法样品＋等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡离心（12000×g）取上清核酸相核酸相Protein变性相变性相有机相有机相 4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH 重蒸：去除醌类氧化物 饱和： 防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 方法：蒸馏（183℃）0.1% 8-羟基喹啉-收集 （棕色瓶）-饱和与调pH≥7.8（Tris- HCl pH8.0）-0.2%β-ME, 4 ℃或-20 ℃保存 8-羟基喹啉的作用：减少酚氧化、提供颜色（黄色）指 示、抑制RNA酶活力、螯合金属离子抑制DNA 酶活性、提取RNA时与VRC作用使酚由黄变黑。

二、 离心技术原 理离心力：离心力： F= ω F= ω 2 2r r RCFRCF=F/g =ω =F/g =ω 2 2r/gr/g = =（（2π 2π ×× N N））2 2r/gr/g =1.119 =1.119××1010-5-5(N)(N)2 2r r g: g: 重力常数（重力常数（980cm/s980cm/s2 2 ）） N: N: 转速（转速（rpmrpm，，revolation per minute)revolation per minute) N=1000 N=1000 （（RCF/11.19r RCF/11.19r ））1/21/2浮力：浮力：K=m-mK=m-mρρ0 0/ / ρρ(M:(M:物质质量，物质质量，ρρ：物体密度，：物体密度，ρρ0 0：：介质介质密度）密度）沉降阻力：沉降阻力：f f··(dx/dt) (dx/dt) （（f:f:摩擦系数，摩擦系数， x x：沉降速度，：沉降速度，t t：：沉降时间）沉降时间）RCF=k+ fRCF=k+ f··(dx/dt)(dx/dt)差速离心差速离心——密度梯度离心密度梯度离心操 作•离心机分类： 普通 6000rpm 高速 10000-25000rpm 超速 30000-80000rpm•平衡•温度-离心力-转速•转头：角转、平转、垂直转三、 凝胶电泳技术 概 论 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳. 1937年首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均迅速发展，已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。

其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选的标准方法原 理•电泳法：电泳法：指带电荷的样品（蛋白质、核酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法    •电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳区带电泳区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等凝胶电泳　　 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸 琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，介绍如下： 等电点：DNA pI=6.0-7.0 支持介质：琼脂糖、PA 分离范围：agarose：100bp～60kb PA：5～500bp F=q × E F’= 6πrην F= F’, ν=qּE/ (6πrη) 泳动率（电泳迁移率）：单位电场强度的泳动速度 U= ν /E =q / (6 π rη) =(d/t)/(V/L) （cm2/V ּ S） 迁移率单位：10-5 （cm2/V ּ S） 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。

除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率电泳影响因素 1. 1. 样品样品DNADNA物理性质物理性质 质粒构象：质粒构象： CCCC＞＞L L ＞＞OCOC 线形：㏒线形：㏒1010M M正比正比1/U (U:1/U (U:泳动率）泳动率） 2. 2. 介质性质介质性质 ㏒㏒1010U= U= ㏒㏒1010U U0 0-K-Kr rT T U U：泳动率；：泳动率；U U0 0：自由泳动率；：自由泳动率；KrKr：介质阻滞系数；：介质阻滞系数； T T：凝胶浓度凝胶浓度 3. 3. 电压电压：：5v/cm, 5v/cm, 电场强度：电场强度：V/LV/L 4. 4. 缓冲液缓冲液 离子强度：离子强度：0.020.02～～0.2 (I0.2 (I＝＝( (ΣΣCZCZn n)/2)/2）） C C：溶液：溶液molmol浓度；浓度；Z Z：化合价；：化合价；n n：原子数目。

原子数目 TAETAE、、TBETBE、、TPETPE5.5.电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电 如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度线形线形DNA的最佳分辨范围（的最佳分辨范围（bp））0.5%1,000～～30,0000.7%800 ～～12,0001.0%500 ～～10,0001.2%400 ～～7,0001.5%200 ～～3,0002.0%50 ～～2,000DNA片段长度片段长度Agarose浓度使用浓度使用Marker种类种类200 bp以下以下3%以上以上DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 200 bp～～700bp2%～～3%DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 700 bp～～1,500 bp1%～～2%λ-EcoT14 I digestDNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 1,500 bp～～5,000 bp 0.7%～～1% λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 5,000 bp以上以上 0.7%以下以下 λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 四、 核酸定量技术原理A=A=㏒㏒1010（（1/T1/T））=-log(I/I=-log(I/I0 0) )= =abcabc a a：消光系数、：消光系数、c c：物质浓度、：物质浓度、b b：介质长度：介质长度浓度：浓度： dsDNA: 1AdsDNA: 1A260260=0.05ug/ul=0.05ug/ul ssDNA ssDNA和和RNA: 1ARNA: 1A260260=0.04ug/ul=0.04ug/ul 引物引物: 1A: 1A260260≈0.033ug/ul≈0.033ug/ul 寡核苷酸：寡核苷酸： 1A1A260260≈0.02ug/ul≈0.02ug/ul纯度：纯度： A A260260/A/A280 280 = 1.6= 1.6～～1.81.8 A A260260/A/A230 230 > 2.0> 2.0 A A260260/A/A280 280 < 1.7< 1.7，， 蛋白质过高蛋白质过高 A A260260/A/A280 280 > 2.0> 2.0，， RNARNA过高过高 A A260260/A/A280 280 =1.8=1.8～～2.0, 2.0, 盐过多盐过多五、 分子杂交技术六、 序列分析技术常用DNA分子量标准思 考 题 1. 市售苯酚为什么要饱和与重蒸？ 2. 离心操作应该注意哪些问题？ 3. 如果要分离470bp和5kb DNA 应该选择什么凝胶？ 4. 在DNA定量时，取10uL DNA待测液， 用TE buffer 稀释到100uL 后，加入到 0.5cm的石英比色皿中。

A260测定为 0.21，问DNA待测液的浓度是多少？ 5. 简述DNA序列分析的基本原理。