(药学论文)绿原酸的生物活性.doc

本研究在以前研究的基础上进行中间试验,利用以下工艺流程从杜仲叶中制得绿原酸纯品: 40%乙醇提取(80℃,2h,1∶16 料液比,提取 2 次)→制备浸膏(真空浓缩,80℃鼓风干燥)→加 水转溶(4 次)→铅盐沉淀(每 100g 杜仲叶用 140g 乙酸铅)→解析绿原酸(20%H2SO4)→乙酸 乙酯萃取(约 20 次)→浓缩析出粗品→重结晶得纯品,平均得率 0.53%,纯度 98.35%研究 中还发现杜仲叶中不含异绿原酸 杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)为杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属植物,富含绿原酸作者曾 对影响杜仲叶中绿原酸提取率的各种因素进行了研究,得出了提取绿原酸的最佳工艺条件[1] 本研究在此基础上,利用所得出的最佳工艺条件进行放大提取试验,用铅沉法对提取出的绿 原酸进行分离,得到 （通常用的最多的是第二种，即分配平衡，）色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、 离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸 附力大小不同而分离。

分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程常用的吸附剂为硅胶或 氧化铝，粒度 5~10μm适用于分离分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合 物，离子型化合物易产生拖尾常用于分离同分异构体 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固 定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离分离过程是 一个分配平衡过程 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表 面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的 固定相也使样品的分离和收集复杂化由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很 少采用现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC) 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调 节组分的保留时间常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨 基酸类等）。

反相色谱法 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间适用于分离非极 性和极性较弱的化合物RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易 解离样品的分析为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值但需 要注意的是，C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.5~7.5（2~8），太高的 pH 值会使硅胶溶 解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落有报告新商品柱可在 pH 1.5~10 范围操作 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固 定相） 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架， 在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。

被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被 测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离 子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用流动相的盐浓度大，则离子强 度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支它是根据被测组分离子与离 子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离 效果改善主要用于分析离子强度大的酸碱物质 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等另外高氯 酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐 离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 3~10 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内进行分离。

被测组分保时间与离子对性质、 浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度有关 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂小分 子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动 相流出它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离常用于分 离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等 采用反相高效液相色谱法测定解毒宣透汤中连翘苷、绿原酸、黄芩苷的含量色谱柱：Hypersil-C18(5μm ，200×4.6mmI.D.)，连翘苷流动相为乙腈：水(21:79,V/V)，检测波长：277nm，平均回收率为 97.0％,R SD=1.3％；绿原酸流动相为甲醇：水：冰醋酸(25:74:1,V/V/V)，检测波长：320nm，平均回收率为 96.1 ％,RSD=2.1％；黄芩苷流动相为乙腈：水：四氢呋喃(20.5:77.5:2,V/V/V，磷酸调至 pH4)，检测波长：27 4nm，平均回收率为 99.5％，RSD=1.4％本法操作简便，结果准确 别名：氯原酸 ,咖啡鞣酸绿原酸英文名： Chlorogenic acid化学名：3 — 咖啡酰奎尼酸 Cyclohexanecarboxylic acid, 3-[[3-(3,4-dihydro xyphenyl)-1-oxy-2-propenyl]oxy]-1,4,5-trihydroxy-1, [1S-(1 α , 3 β , 4 α , 5 α )]系统名：1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸 -（3，4-二羟基肉桂酸酯）产品名称：绿原酸 ; (1S,3R,4R,5R)-3-[[3-(3,4-二羟基苯基 )-1-氧代-2-丙烯基]氧] -1,4,5-三羟基环己烷甲酸 分子式及分子量： C16H18O9=354.30 绿原酸植物来源 :主要存在于金银花、杜仲叶中.其产品分别为金银花提取物 杜仲提取物绿原酸物理性状：半水合物为针状结晶（水）。

110 ℃变为无水化合物，熔点 208 ℃， [ α ]24 D-35.2 ℃（ c=2.8）25 ℃水中溶解度为 4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及 丙酮，极微溶于醋酸乙酯 13CNMR（H2O）A：126.6(C-1), 114.1(C-2), 144.2( C-3), 147.0(C-4), 116.0(C-5), 122.6(C-6), 145.9(C-7), 115.2(C-8), 168.9(C-9); B: 76.6(C-1), 38.3(C-2), 70.6(C-3), 72.8(C-4), 71.0(C-5), 37.3(C-6), 180.1(C-7) [1] [编辑本段] 绿原酸作用与用途：具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活 [11] 与咖啡酸相似，口服 或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的 张力有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌 [12-14] 对人有致敏作用，吸入含有本 品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等，但食入后可经小肠分泌物作用，变为无致敏性 物质 [15,16] 有止血、增高白血球 [17] 及抗病毒作用 [18] 。

具有缩短血凝及 出血时间的作用 [19] 毒性很小，幼大鼠口服的 LD50 大于 1g/kg ，腹腔注射大于 0.25g/kg[20] 1) 降压作用：经多年临床试验证实的，杜仲绿原酸有明显的降压作用，而且疗效 平稳，无毒、无副作用美国威斯康星大学（ Charles J Sih, et al . Separation and synthesis of pinoresinol diglucoside moides olive J Am Chem Soc 1976, 98(17):5412 等研究发现杜仲绿降血压的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃叶珊瑚甙， 绿原酸，和杜仲绿原酸多糖类2) 抗肿瘤作用：现代药理实验证明杜仲绿原酸有抗癌和抑癌之功效，日本学者研 究了杜仲绿原酸的变异原性抑制作用 (antimutagenicity)，发现该作用与绿原酸等抗变 异原性成分有关，揭示了绿原酸对肿瘤预防的重要意义3) 补肾、增强机体免疫作用：实验表明明杜仲绿原酸具有兴奋垂体－肾上腺皮质 系统、增强肾上腺皮质功能的作用，说明杜仲绿原酸作为助阳补肾是有科学依据的研 究发现杜仲绿原酸既能启动单核巨噬细胞系统和腹腔巨噬细胞系统的吞噬活性，增强机 体的非特异免疫功能，又能对迟发型超敏反应起抑制作用。

4) 抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化：杜仲绿原酸含有一种可促进人体的皮肤、 骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能，可用 来预防宇航员因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体内还 是体外，均有明显抗自由基作用5) 抗菌、抗病毒：杜仲绿原酸有较强的抗菌消炎作用，桃叶珊瑚苷及其多聚体有 明显的抑菌作用，桃叶珊瑚苷元对革兰氏阴性、阳性菌都有抑制作用桃叶珊瑚苷有抑 菌、利尿作用，并能促进伤口愈合；桃叶珊瑚苷与葡萄糖苷一起预培养后还会产生明显 的抗病毒作用，但其本身开不具有抗病毒功能日本爱知医科大学加龄医科学研究所经研究确认，从杜仲中提取的碱性物质有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，这种物质有可 能用于预防和治疗艾滋病6) 其它作用：利尿，利胆，降血脂，保胎 绿原酸的生物活性绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，通常被作 为定性甚至定量的指标 据报道，绿原酸的主要生物活性有（ 1）对透明质酸酶及 葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（ 2）对自由基的清除及抗脂质过氧化作用；（ 3）抗 诱变作用；（ 4）保肝利胆作用；（ 5）抗菌、抗病毒及解痉等作用。

检测方法南京泽朗杨东骋敬告：绿原酸易分解照高效液相色谱法（附录 Ⅵ D）测定 色谱条件与系统适用性试验 用 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈 -0.4%磷酸 溶液（13：87）为流动相；检测 波长为 327nm理论板数按绿原酸峰计算不低于 1000 对照品溶液的制备 精密 称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加 50%甲醇制成 每 1ml 含 4μg 的溶液， 即得（10℃以下保存）酯化反应醇跟羧酸或含氧无机酸生成 酯和水，这种反应叫酯化反应 50-150 分钟 绿原酸是一种重要的生物活性物质和化学试剂在我国 1 70种有抗菌消炎作用的中 成药中均含有绿原酸的成分它具有具有利胆、抗菌、抗病毒、降压、增高白血球及兴奋 中枢神经系统等多种药理作用 [1] ,是保健品、食品、药品、化妆品等工业的重要原料目 前我国提取绿原酸多以金银花为原料 ,其绿原酸提取成本高 ,导致目前应用的绿原酸多从国 外进口研究表明 ,杜仲叶中含有 1 %～ 5 .5 %绿原。