兔抗制备方法.doc

基本方案（肌肉内注射免疫法）1. 取2 ml的弗氏完全佐剂加到2 ml的溶于PBS的纯化抗原中，使之乳化 用3 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡2. 将兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的颈背部毛皮，另一只手托住兔的后 腿及臀部，将兔束紧固定以使后肢不能伸张，用 70%乙醇对所要注射的区域进 行清洁消毒，在后肢大腿肌肉内进针约1 cm 深，毎条大腿肌肉内最多注射0.5 ml 乳化液3. 四周后，用 1 mg 的混溶干弗氏不完全佐剂的抗原乳化液（1：1）对兔进行 肌肉内加强免疫注射，操作步骤同1 和2 ，初次加强免疫后2周再次进行加強免 疫注射4. 第二次加强免疫注射 10 天后，从兔的耳缘静脉处放血1） 先将兔固定在固定架上（固定紧），使其耳朵伸出，用70%乙醇洗洁消毒 一侧耳朵2） 将兔耳置于热灯之下，用手指轻轻地拍打兔耳；1~2 min 内兔耳上的血管 即会充分地充盈3） 用一消毒过的解剖刀 的锋尖在兔耳缘静脉上迅速划一长约0.5 cm 的小 口，收集兔血于 50 ml 的塑料离心管中，直至伤口不再流血为止4） 使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血5. 将兔耳擦拭干净，涂以 70%乙醇，在耳朵伤口上涂一层凡士林，以减轻由乙 醇产生的皮肤刺激感。

6. 将兔血在室温下静置数小时后置4 °C过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻地挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血洧移到合适的离心管中， 5 000 g 离心 10 min，去除残留的红细胞及其他碎片7. 每两星期进行进一步的加强免疫每次加强免疫后10天，可采集一次兔血， 兔的两只耳朵可轮流交替进行采血8. 采用ELISA法或RIA法对血清中的特异性抗体进行滴度测定如果需要的 话备用方案 1 （皮内注射免疫法）1. 按基本方案中步骤 1 制备免疫兔用的抗原2. 牢牢地抓住兔子，剃除其背毛，用70%乙酵消毒其暴露的皮肤用拇指和食 指将需要免疫注射的区域的皮肤张开，用 3 ml 注射器带 24G 注射针头以相对皮 肤 30 的角度进针（针尖的斜面朝上），进针深度只达外皮层之下放低注射器，使之平放在兔的背部上，将＜100 pl的乳化抗原注射进真皮层间，与前操作相同， 分别在兔的背部选择其他4个部位，并注射不大于100 pl的相同杭原3. 用弗氏不完全佐剂对家兔肌肉注射，进行加强免疫，步骤方法同基本方案 如果肌肉内注射加强免疫 2 次之后仍不能获得高滴度的特异性抗体，那么就应采 用皮内注射加强免疫，但只能注射 2 个部位。

备用方案 2 （皮下组织注射免疫法）1. 准备用于注射家兔的抗原，并准备用于皮下注射免疫的家兔（方法同皮内注 射）2. 将家兔背部皮肤捏出，以远离其下的肌肉，用 24G 注射针头全程穿剌，进入 皮下，小心勿刺入肌肉组织中，在 4 个不同的部位各注射 0.5 ml 抗原3. 用不完全弗氏佐剂进行家兔肌肉内法射以加强免疫（见基本方案）或者采用 皮下组织注射，方法同上备用方案 3（耳动脉放血法）1. 准备用于放血的家兔（见基本方案）2. 将靠近家兔头部的半只耳朵托在梅指和食指上，用中指和无名指弯曲剩余的 半只耳朵使之下垂，以便使血液随重力下流，用一个 18G 注射用针头（不带注 射器）沿着兔耳中动脉进针，针尖指向兔耳根部3. 进针后，将注射用针头推进5~10 min,小心勿伤及动脉血管壁，用一支50 ml 的塑料离心管收集兔血（见基本方案），之后出针止血，并包扎兔耳。