免疫组化总结(猪羊).docx

免疫组化阶段总结一 实验所用试剂配方：1 苦味酸饱和液的配制：1缓冲液 lxTBS:6.06g TRIS,8.5g NaCL，先加超纯水溶解（约800ml ）然后使用pH计调节pH至7.4，定容至1L2抗原修复液：根据Sigma抗体说明书配制IX柠檬酸钠缓冲液（O.lmol/1 ）：二水柠檬酸三钠2.941g； 0.292g EDTA加超纯水溶解（约800ml）,调节pH至6.0, 定容至1L1 X Tris/EDTA： 4.84g Tris,3.72g EDTA,加超纯水溶解（约 800ml ）调pH至9.0,定容至1L （先加较多NaOH ）3细胞通透液：使用超纯水配制0.5 % Tritonx-100，在100ml 超纯水中加入0.5ml Tritonx-100后轻轻搅拌，尽量不要产生 气泡，直至溶解完全方可使用4圭寸闭血清：根据二抗来源选择圭寸闭血清，一般血清来源于 二抗来源形同血清浓度为 10％,TBS 配制，或者使用 3% BSA配制10 %封闭血清5 抗体稀释液：使用 TBS 配制 3% BSA6 3 %H2O2： 30 %H2O2，超纯水配制7 DAB显色液（试剂盒）配制：1mlTBS中加50mlA液,50mlB 液，充分混匀。

8荧光二抗的配制：Alexa Flour488、594规格为2mg/ml,说 明书建议使用浓度在 2ug/ml-10ug/ml 之间，所以建议稀释 200-1000倍，木实验所使用浓度为5ug/ml，即稀释400倍 二组织采集与处理材料：取不同时间点猪的睾丸组织观察精原干细胞的表达， 新生小猪，3-5 月龄,成年猪采集适龄猪睾丸组织，置于PBS中带回实验室，用PBS清洗 若干次，将睾丸白膜去除，组织切成适宜大小，用苦味酸固定过 夜，次日进行清洗（PBS） 3-4次，每次30min,然后用70%酒精 清洗3次，每次30min,储存于70%酒精备用包埋：80 %酒精--90 %酒精一100 %1酒精--100 %11酒精各 30 min,无水乙醇：二甲苯1:1 2h，二甲苯I,二甲苯II依照所 取组织大小确定处理时间，二甲苯：石蜡1:1 2h,石蜡I1h，石蜡 II 2h，包埋组织切片：7um，37°C烤片5h三 免疫组化（SP法，各种抗体稀释浓度附于后表）：1脱蜡：二甲苯I、II各5 min复水：100 %乙醇I、11，90 %乙醇,80 %乙醇,70 %乙醇 各3min，超纯水清洗5min*3次。

2用超纯水配制0.5 %的Tritonx-100,室温孵育10min，超纯 水清洗 3*5min 3抗原修复：柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L,pH=6）高压修复： 将玻片同修复液（1L烧杯）一起放入高压锅内，加热加压至125°C,修复5 min,放气后降温至90°C时将烧杯拿出自然冷却至室温TBS清洗3*5min ；微波修复：柠檬酸钠缓冲液加热煮沸,将玻片置入烧杯内加热6min，停lmin,重复3次，冷却；煮沸修复：Tris/EDTA（pH=9 ）置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾，水浴锅提前加热至99C置入玻片修复10 min.自然冷却TBS清洗3*5min4 3%H 0 （试剂盒）孵育 10 min., TBS 清洗 3*5min2 25封闭血清（试剂盒），封闭2h，勿洗6 一抗稀释：含3%BSA的TBS置于湿盒，4°C过夜7 次日，取出湿盒，恢复至室温 40min， TBS 清洗 3*5min8二抗（试剂盒）室温孵育30 min，TBS清洗4*5min9辣根过氧化物酶（试剂盒）室温孵育30 min，TBS清洗 4*5min10 DAB显色，用倒置显微镜严格控制显色时间，待背景染 色浅，特异性染色深时，终止染色， TBS 清洗 2*5min。

11苏木精：3min，清洗（流水冲一下）后，5%冰醋酸分化30秒（可短些），流水蓝化5min，脱水 （70 %,80 % ,90 %,100 %1 ,100 %11酒精各 lmin），二甲苯透明1min，中性树胶圭寸片四免疫荧光染色（各种抗体稀释浓度附于后表）：1脱蜡：二甲苯I、II各5 min复水：100 %乙醇I、11, 90 %乙醇,80 %乙醇,70 %乙醇 各3min，超纯水清洗5min*3次2用超纯水配制0.5 %的Tritonx-100,室温孵育lOmin，超纯 水清洗 3*5min 3抗原修复：柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH=6)高压修复：将玻片同修复液(1L烧杯)一起放入高压锅内，加热加压至125°C,修复4 min,放气后降温至90°C时将烧杯拿出 自然冷却至室温TBS清洗3*5min ；微波修复：柠檬酸钠缓冲液加热煮沸,将玻片置入烧杯内加热6min，停lmin,重复3次，冷却；煮沸修复：Tris/EDTA (pH=9 )置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾，水浴锅提前加热至99C置入玻片修复10 min.自然冷却TBS清洗3*5min4封闭血清［(10%),使用TBS稀释，封闭2h，勿洗(置于 湿盒)。

5 一抗稀释：用含3%BSA的TBS稀释后置于湿盒，4°C过夜6 次日，取出湿盒，恢复室温 40 min， TBS 清洗 3*5min7荧光二抗：含3%BSA的TBS稀释，p7C (提前打开烘箱)， 30 min，避光(以后都注意)，TBS清洗4*5min第一次 使用加Tween20(0.05 %)的TBS清洗，二，三，四次使用TBS,每次 5min8 DAPI：室温10min,TBS稀释，TBS清洗一次即可9 80 ％甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察五免疫双荧光染色（各种抗体稀释浓度附于后表）：1脱蜡：二甲苯1、11各5 min复水：100 %乙醇I、11, 90 %乙醇,80 %乙醇,70 %乙醇 各 3min， TBS 清洗2用超纯水配制0.5 %的Tritonx-100,室温孵育10min，超纯 水清洗 2*5min3 抗原修复：柠檬酸钠缓冲液（ 0. 1 mol/L,pH=6 ）高压修复：将玻片同修复液（1L烧杯）一起放入高压锅内，加热加压 至125°C,修复4 min，自然降温至90°C,放气，将烧杯 拿出自然冷却至室温； 微波修复：柠檬酸钠缓冲液加热煮沸，将玻片置入烧杯内， 加热6min，停1min,重复3次，冷却；煮沸修复：Tris/EDTA （pH=9）加热至沸腾，水浴锅调至99C.置入玻片修复10 min.自然冷却。

TBS 清洗 3*5min4封闭血清（10%），TBS稀释，封闭2h，勿洗5 一抗稀释：使用含 3%BSA 的 TBS 稀释，两种抗体混合稀 释，如要配制 50ulTHY1-PLZF 抗体，则用 50ul 抗体稀释 液中加lulTHYl和lulPLZF置于湿盒，4C过夜6 次日，取出湿盒，恢复室温 40 min，TBS 清洗 3*5min 7 荧光二抗：含 3 ％BSA 的 TBS 稀释，两种抗体混合稀释， 如需要 400ul 双荧光二抗，则在 400ul 抗体稀释液中分别 加入 1ul 488 和 594,7°C,30 min,避光，TBS 清洗 4*5min第一次使用加Tween20（0.05 %）的TBS清洗，二，三，四 次使用TBS，每次5min8 DAPI:室温10min,TBS稀释，TBS清洗一次即可9 80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察各种抗体适合修复方法及稀释比例（猪，羊）种属抗体稀释比例 （SP 法）荧光修复液修复方法猪PGP9.5 （5 月）1:10001:500柠檬酸钠缓 冲液高压VASA（5 月）1:4001:400Tris/EDTA煮沸GPR125（3,5 月）1:1001:50Tris/EDTA煮沸THY1（5 天，10 天，3月）1:1001:50Tris/EDTA煮沸PLZF（10 天，3 月）1:1001:50Tris/EDTA煮沸GATA4（10 天，3 月）1:1001:50柠檬酸钠缓 冲液高压DBA（10 天）1:100未作柠檬酸钠缓 冲液微波小鼠LIN281:200未作柠檬酸钠缓 冲液高压VASA1:400未作Tris/EDTA煮沸或咼压大鼠PGP9.5（2 周）1:15001:1000Tris/EDTA煮沸注意事项：1 组织处理时，组织快不能切太小，否则不能保证切片数量；不能切太小，否则透明时间和浸蜡时间不好把握。

切 片厚度以 5um 或 7um 为佳，贴片需使用多聚赖氨酸包被的 玻片，展片是要把握好展片温度，一般多聚甲醛与苦味酸固 定的组织所用温度不同，苦味酸大概所需温度为45°C左右， 多聚甲醛为42C左右，展片后要在37C烘烤4-6小时2 包埋蜡温度不宜过高，以免烫坏组织，切片时易碎， 透明时间要依据组织块大小准确把握3 脱蜡要彻底，复水后使用超纯水将酒精清洗干净， TBS 缓冲液和抗原修复液的 pH 值要准确，否则不利于抗原抗体 复合物的形成4 抗原修复后要自然冷却，切不可立即清洗，易造成脱片， H2O2 浓度不能太高，孵育时间不宜太长，否则易脱片5 血清封闭后勿洗，加一抗前使用离心机将一抗离心，加稀释液后，用枪反复吹打，一定要将一抗混匀6 次日将湿盒从冰箱拿出后恢复至室温，如若使用了不 同抗体，清洗时要分开清洗7 二抗孵育完后可多次清洗以减少背景，免疫组化后苏 木精复染要把握好时间，以免苏木精颜色过深影响免疫组化 效果，免疫荧光染色一定要避光操作，孵育时可置于恒温烘 箱中，清洗时可用锡箔纸包住染色缸作好免疫组化染色必须注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经 多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。

因为肿瘤组织中含有的抗原较易 发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液 供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散 布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式另一种抗原弥散的方 式就是，由于组织没有及时的固定所引起的离体的组织不及时固定，组织就会 自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易标本从 外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生 扩散虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液 的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着 发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大， 虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要 几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化因此，这了达到免 疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖 开，早取材，早固定二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程如果取材太厚，在较短 的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成， 切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由 此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。