酵母单杂交.docx

酵母单杂交— 研究蛋白质与特定 DNA 序列之间的相互作用酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来的，酵母双杂交技术通过对报告基因的表 型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型 检测，分析 DNA 与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控• 顺式作用元件存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个 作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控• 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率 的蛋白质酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合 调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因cDNA)的有效方法其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activationdomain AD)组成BD可识别DNA上的特异序列，并使转 录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所 调节的基因的转录。

两个结构域各据功能，互不影响单独的 BD 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录 ) 这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或 非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的 功能用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子研究表明GAL4的DNA结 合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)； 而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子 TFIID 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性 在这一过程中， DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解 的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下 游报告基因的转录 >BaitMinim； al Pi ornate r转录因:表达顺式元件顺式元件顺式元件报告基因■--cDNA文库筛选一基因编码产物cDNA融合表达载体酵母细胞Pmin首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株; 再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用 ,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选 出来.转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin,使报告基因表达，若连接如3个以上 顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。

酵母单杂交系统由 2 部分组成：(1) 将文库蛋白片段与 GAL4 转录激活域 融合表达的 cDNA 文库质粒；(2) 含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.Poty A* or total RKATdsiiiongoKfT) or ranoow purerficst-itandsymr^tu