第八章克隆基因的表达课件.ppt

第八章第八章-克隆基因的表达克隆基因的表达遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程-中心法则中心法则 一、基因表达：一、基因表达：二、克隆基因的表达：二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达外源基因在宿主细胞中表达外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞： 原核细胞或真核细胞原核细胞或真核细胞三、制约目的基因表达的因素：三、制约目的基因表达的因素：1. 外源基因是否插入在正确的阅读框架外源基因是否插入在正确的阅读框架2. 目的基因的有效转录（如启动子的作用）目的基因的有效转录（如启动子的作用）3. mRNA的有效转录（如的有效转录（如S-D序列等作用）序列等作用）4. 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程所谓所谓表达体系表达体系，是由，是由目的基因目的基因、表达载体表达载体与与宿主细胞宿主细胞组成的完整体系组成的完整体系四、在原核细胞内正确表达的基本条件：四、在原核细胞内正确表达的基本条件：必须能够必须能够正常地转录和翻译正常地转录和翻译1. 外源基因外源基因不能带有间隔序列不能带有间隔序列（内含子）（内含子）真核基因必须用真核基因必须用cDNA或全化学合或全化学合成基因，不能用基因组成基因，不能用基因组DNA2. 必须利用原核细胞的必须利用原核细胞的强启动子强启动子和和S-D序列序列等调等调 节元件控制外源基因的表达节元件控制外源基因的表达3. 外源基因和表达载体连接后，必须形成外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架正确的阅读框架阅读框架阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列4. 通过通过表达载体表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的宿主菌的 酶系统酶系统合成外源蛋白合成外源蛋白表达载体：表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体适合在受体细胞内表达外源基因的载体5. 利用宿主菌的利用宿主菌的调控系统调控系统，调节外源基因表达，防止外源，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对宿主菌毒害基因表达产物对宿主菌毒害用原核生物作宿主用原核生物作宿主A dividing E. coli第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所有的RNA合成。

合成数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位达的协同单位一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点2. 以操纵子为单位以操纵子为单位1. 只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶有意义链有意义链5反意义链反意义链3转录转录mRNA53翻译翻译蛋白质蛋白质NC533. 转录和翻译偶联、连续进行转录和翻译偶联、连续进行4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统不含内含子，缺乏转录后的加工系统5. 调控主要在转录水平上调控主要在转录水平上 含有一个启始密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端末端碱基互补的序列，叫碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列Shine-Dalgarno（S-D）sequence:6. mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子外源基因不能带有内含子2. 必须用必须用cDNA3. 不能直接用真核基因组不能直接用真核基因组DNA4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害防止外源基因产物对宿主细胞的毒害是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

合成的序列大大肠肠杆杆菌菌的的所所有有启启动动子子中中都都有有两两段段一一致致顺顺序序（consensus sequence）三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控1. 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box（1） 启动子序列启动子序列 consensus sequences5-TTGACA-35-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACATATAAT转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点 -35box原核启动子共有序列的功能原核启动子共有序列的功能（2）翻译的起始位点）翻译的起始位点核糖体结合位点（核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列结合的序列ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于位于SD序列下游。

序列下游ii）起始密码：）起始密码：全酶是一个全酶是一个5聚体，含有两个聚体，含有两个小亚基小亚基，和，和2两个大两个大亚基（亚基（和和），一个），一个亚基2. RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA1）结构）结构3. 转录终止子转录终止子内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有一段位置有一段反反向回文顺序向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内终止，称为内终止子，形成终止信号子，形成终止信号在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续有利于转录物脱落而不利于转录延续 原因：原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNA折叠折叠U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。

一般安置上一般安置上全部的三个终止全部的三个终止密码密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）4. 翻译终止密码翻译终止密码5. 翻译增强子翻译增强子Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列效率的特殊序列T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段21 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的白的10%-30%以上 应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等便于表达毒性蛋白等应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导用温度或化学试剂诱导1）最佳启动子必须具备的条件）最佳启动子必须具备的条件6. 基因工程常用的原核启动子基因工程常用的原核启动子 来自大肠杆菌的乳来自大肠杆菌的乳糖操纵子糖操纵子用乳糖或其类似物用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，充当诱导物，与阻遏蛋白结合，与阻遏蛋白结合，解除抑制。

解除抑制Plac O 目的基因目的基因（2 2） 乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子laclac阻遏物与操纵基因结合阻遏物与操纵基因结合四聚体的四聚体的阻遏物阻遏物阻遏物与阻遏物与DNA的结合的结合乳糖操纵子控制区的结构乳糖操纵子控制区的结构阻遏物作用区阻遏物作用区CAP作用区作用区RNA聚合酶作用区聚合酶作用区组成：组成：长度：长度：203bp的的HaeIII片断片断（包括（包括-半乳糖苷酶的前半乳糖苷酶的前8个密码）个密码）可移动的可移动的lac启动子小片断启动子小片断”IPTG有毒、昂有毒、昂贵，不理想贵，不理想IPTG =异丙基硫异丙基硫代代-D半乳糖半乳糖（3）色氨酸启动子）色氨酸启动子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；操纵基因； 衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子色氨酸操纵子色氨酸操纵子trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油磷酸合成酶磷酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶 链链 链链分支酸分支酸邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录（P1是主要启动子，是主要启动子，P2的作用只有的作用只有3%）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。

能转录合成色氨酸所需要的酶trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般只包含启动启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分基因、操纵基因、和部分trpE基因P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（4）PL和和PR启动子启动子是从是从 噬菌体中得到的一类启动子，比噬菌体中得到的一类启动子，比lac启启动子的活性高动子的活性高8-10倍，比倍，比trp启动子活性高启动子活性高cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗终止蛋白；抗终止蛋白；Cro: 抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；阻遏蛋白；P:启动子；启动子；O:操纵子R:右；右；L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物转录转录转录转录转录转录当当cI合成后，与合成后，与OL和和OR结合阻止结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。

但促聚合酶，则左右基因都受到抑制但促进进PM使使cI进一步转录进入溶原期进一步转录进入溶原期早期左边早期左边早期右边早期右边cI857:表达载体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL调节基因调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变则是选择了一个温度敏感性的突变基因基因cI857整合在宿主基因组里，或克隆到载体上整合在宿主基因组里，或克隆到载体上42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录时阻遏蛋。