3'RACE特异性引物设计原则.docx

RACE技术-引物设计基因特异性引物（GSPs ）应该是：1、 23—28nt2、 50—70%GC3、 Tm值＞65度，Tm值＞70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和 3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2）,由于两个引物的存在，PCR的产物是特异 性的4、 cDNA的合成起始于polyA+RNAo如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高5、 RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火 和延伸温度6、 在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动7、 重叠引物的设计会对全长的产生有帮助另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对 照并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段8、 引物GSP中的GC含量要在50—70%之间这样可以使用降落PCR避免使用自身互补 性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键另外，避免使用与AP1互补的引物，尤 其是在3‘末端9、 如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp 1和GSp2之间至少是100—200碱基只有这 样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确10、 降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。

在最开始的循环中，退火温度高 于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增随后的退火和延伸的温度降回到AP1 的温度，可以进行随后的PCR循环11、 验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照这样不应该产生任何的条带 如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步为 了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对 照可以产生两个引物之间的重叠大小的片段如果没有这个片段，应该重复cDNA的合 成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成12、 制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水纯化完mRNA之后，利用琼脂 糖凝胶电泳检测mRNA的质量哺乳动物的mRNA样品是0.5 —12kb的拖带，在其中有4.5 和1.9kb的rRNA的条带非哺乳动物的mRNA应略小需要声明的一点是，做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同，5’RACE的GSP和NP 引物为cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。

用软件或经验公式 提供的退火温度只是一个参考值，在具体操作中要灵活多变。