实验四 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清.ppt

实验四 醋酸纤维薄膜电泳法 分离血清蛋白 实验目的›掌握电泳法分离血清蛋白质的原理；›掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操 作方法1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移 动的现象在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点 而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向 和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使 它们分离 2.影响电泳迁移率的因素：内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗 现象实验原理3.血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间， 在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向 正极泳动血清中各种蛋白质的等电点不同，所 以带电荷量也不同此外各种蛋白质的分子大小 各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同 分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢 4.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯 乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成 为醋酸纤维素薄膜该膜具有均一的泡沫状的结 构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分 子移动阻力很小该薄膜电泳具有微量、快速、 简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优 点。

现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、 血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面5. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速 度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球 蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染 色可计算出各蛋白质的百分含量实验器材1. 电泳仪：为电泳提供直流电源 2. 电泳槽：为电泳提供场所 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或微量加样器 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、镊子等 实验材料和试剂材料：牛血清 试剂： 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6) 2、0.5% 氨基黑10B染色液 3、漂洗液实验操作1. 电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲 液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极 每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭 在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥 点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上2. 醋酸纤维素薄膜的润湿将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min 后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸 中，并用滤纸吸干表面液体 3.点样把膜条铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点 样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在 膜条一端1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起 ，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

此 步是实验的关键4.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸 桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架 上(见下图)要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间 不能下垂连接好电泳仪在室温下电泳，打开电源开关 ，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度电泳时间约为1h 电泳后，关闭电泳仪切断电源5.染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染 色液的培养皿中浸泡5-10min染色液回收） 6.漂洗：将薄膜从染色液中取出,自来水下冲洗除去多 余的染色液后放入盛有漂洗液的培养皿中漂洗， 直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带 清晰的电泳图谱 正常血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白， 6为点样原点注意事项1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸 去，吸水量以不干不湿为宜 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免 损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不 宜过多或过少 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端 ，且点样面向下 6、应控制染色时间。

时间长，薄膜底色不易脱去 ；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不 均匀，必要时可进行复染思考题1、比较醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳的异同点 ￿￿ 2、指出醋酸纤维薄膜用作电泳的支持物有何 特点?￿￿。