芦荟大黄素苷及DNA相互作用探究.doc

芦荟大黄素昔及DNA相互作用探究;;作者：韦欣煜，梅文杰,刘云军【摘要】；目的探讨芦荟大黄素昔与DNA的相互作用 方法采用电子吸收光谱，荧光发射光谱，粘度实验以及凝 胶电泳实验进行研究结果与结论芦荟大黄素以插入方式 与DNA分子结合；较高浓度的芦荟大黄素昔能够使 Bel 7402肝癌细胞DNA由超螺旋构型转化为缺刻构型关键词】；芦荟大黄素昔；分子识别；凝胶电泳；DNAAbstract:The binding properties of barbaloin to DNA were investigated by UV visible electron absorption spectrum,fluorescence emissi on spectrum,viscosity measurement and gel electrophoresis,and insertion of barbaloin to DNA was identified.Higher concentration of barbaloin could con vert DNA configuration of hepatoma carcinoma cell Bel 7402 from superhelix to indention.Keywords:barbaloi n; molecular recog nition; DNA芦荟是一种传统的常用中药，用于治疗如烧伤、烫伤等疾病并被广泛应用于食品和化妆品等行业，并被。

芦荟大 黄素昔（图1）是芦荟块茎的主要成分，异芦荟大黄素昔是植物 中的主要存在形式，通过非酶催化转化为芦荟大黄素昔，因 此通常得到的是芦荟大黄素昔和异芦荟大黄素昔的混合物[1 ,2]o芦荟的抗菌、抗炎、抗氧化作用等与芦荟大黄素 昔的存在密切相关[3,4 Jo在生物体内芦荟大黄素昔通过 代谢转化为芦荟大黄素而发挥药理作用[5 , 6 L图1;芦荟大黄素昔和异芦荟大黄素昔的分子结构（略）Fig.1; The molecular structure of barbaloin andisobarbaloin近年来的研究表明，芦荟大黄素具有抑制肿瘤细胞生长的作用[7-12 ]o研究发现芦荟大黄素能促进人早幼粒HL 60白血病细胞P27基因过度表达，并诱导肿瘤细胞凋亡[13 ]□ —般认为DNA是抗肿瘤药物的靶点之一 [14 ]□药物分子可以通过共价结合、插入作用、沟结合方式或静电 结合方式与DNA分子缔合，对DNA的构象产生微扰，达到 抑制肿瘤生长的目的本文采用荧光光谱和流体力学方法研究了芦荟大黄素 昔与DNA分子的缔合机理结果表明芦荟大黄素昔能够以 插入方式与DNA分子结合；凝胶电泳实验结果表明，光照 下芦荟大黄素昔能够使Bel 7402肝癌细胞DNA的超螺旋 构型发生一定程度的转化。

1;实验部分1.1;仪器与试剂芦荟大黄素昔由中山大学化学与化学工程学院陆伟刚 博士提供;Bel 7402肝癌细胞由中山大学肿瘤研究所提供 所用化学试剂均为分析纯，除非另有说明，所有试剂未作任 何处理芦荟大黄素昔用5 mmol/L Tris HCI,50 mmol/L NaCI(pH=7.2)缓冲溶液配制小牛胸腺DNA (华美公司)； 电泳级琼脂糖(Promega公司\ MPS 2000型紫外可见光 谱计(Shimadzu ) ; RF 2000型荧光分光光度计 (Shimadzu );乌氏粘度计；DYY山4型稳压稳流电泳 仪(北京六一仪器厂L1.2;实验方法1.2.1; Bel 7402肝癌细胞的提取按文献方法［15 ］进行：收集培养好的Bel 7402肿瘤细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤,14 000 r/min离心5 min，收集底部白色固体沉淀，重复3次，加入RNase A( 20 mg/mL )50 pL和 质量分数为10%的SDS 20 |JL , 56 °C孵育2 h,然后加入蛋白酶K ( 20 mg/mL ) 35 pL , 37 °C孵育24 h,加入 10 mol/L NH4OAc 150 pL 和无水乙醇 1.2 mL , 20 °C过夜， 得到DNA的溶液,离心、干燥后,将DNA溶解在150 pL Tris HCI缓冲溶液中。

1.2.2;紫外-可见吸收光谱实验在参比池和样品池中分别加入等量的DNA以消除 DNA本身的吸收，当芦荟大黄素昔的电子吸收光谱不再变 化，此时吸收滴定达到饱和1.2.3;荧光光谱实验在样品池中加入一定体积的芦荟大黄素昔溶液，每次 往池中加入一定体积的DNA ,直至荧光光谱不再变化1.2.4;粘度实验在(25±0.1) °C恒温水浴中使用乌氏粘度计测量DNA 的流出时间用数字秒表测量得到，每个样品测量3次，取3 次测量的平均值，以(q/n0)1/3芦荟大黄素昔的浓度作图[16 Jor| = t -t 0q：DNA的粘度；t:DNA溶液的流出时间；t0:缓冲溶》 的流岀时间；口0:没有加入芦荟大黄素昔时DNA的粘度1.2.5;电泳实验TBE缓冲溶液中、1 %的琼脂糖凝胶上进行，电泳电压 30 V ,电泳40 min ,漠乙锭染色，照相2;结果与讨论2.1; DNA对芦荟大黄素昔电子吸收光谱的影响电子吸收光谱是研究小分子化合物与生物大分子相互 作用的常用方法之一室温下Tris HCI(pH=7.2)缓冲溶液 中，芦荟大黄素昔在300-400 nm之间有一个强的tt tt* 跃迁，其电子吸收峰的最大值为359 nm。

当向溶液中加入 小牛胸腺DNA以后，芦荟大黄素昔的电子吸收光谱出现明 显减色效应，其电子吸收降低约5%(AA=1 nm),见图2图2;芦荟大黄素昔与DNA作用的紫外可见光谱变化 图(略)Fig.2; The electronic spectra of barbaloin in the absence and in presenee of CT DNA2.2; DNA对芦荟大黄素昔荧光发射光谱的影响室温下，Tris HCI缓冲溶液中，当用260nm波长激 发，芦荟大黄素昔在360 ~440 nm之间有一个荧光发射峰， 其荧光发射峰的最大位置在372 nmo当向溶液中加入小牛胸腺DNA后，芦荟大黄素昔的荧光发射峰明显增强见图3 这可能是芦荟大黄素与DNA分子结合后，由于DNA双螺旋 链具有疏水性作用，能够保护芦荟大黄素分子不受水分子的 淬灭作用图3;芦荟大黄素昔与DNA作用的荧光发射光谱变 化图（略）Fig.3; The emission spectra of barbaloin in absenee and in presence of CT DNA2.3;芦荟大黄素昔对DNA粘度的影响当小分子化合物与DNA分子作用后，由于其作用模式的不同，对DNA的粘度将产生不同的影响。

一般来说，当化合物以插入方式与DNA分子作用后，由于化合物分子嵌 入到DNA的碱基对中，使DNA双螺旋链拉张，将导致DNA 的粘度上升；而以沟面结合方式与DNA作用的化合物，由 于使DNA双螺旋链发生不同程度的折叠和扭曲，将使其粘 度下降；以静电作用方式与DNA分子结合的化合物，对其 粘度的影响则出现无规律的变化芦荟大黄素昔对小牛胸腺DNA的粘度的影响见图4从图中可以看到，当DNA溶液 中加入芦荟大黄素昔后，DNA的粘度明显增强，表明芦荟大 黄素昔是以插入方式与DNA分子结合图4; DNA溶液粘度变化图(略)Fig.4; The viscosity of CT DNA in presence of barbaloin.EB(A) ; barbaloin (■)2.4;芦荟大黄素昔对Bel 7402肝癌细胞DNA的光 裂解作用一般来说，不同构型DNA在电场中迁移速率不同具 有超螺旋结构的DNA分子由于结构紧密，在电场中迁移速 率最快，而缺刻构型的DNA破坏了 DNA的双螺旋结构，在 电场中的迁移速率最慢，线性构型DNA分子在电场中迁移 的速率居于两者之间芦荟大黄素昔对Bel 7402肝癌细胞 DNA的影响见图5o从图中可见，当体系中未加入芦荟大黄 素昔时(Lane 1),Bel 7402肝癌细胞DNA主要是以超螺旋 构型存在(Form I);当向体系中加入低浓度的芦荟大黄素 (Lane 2-4),Bel 7402肝癌细胞DNA构型无明显变化 但是 在高浓度芦荟大黄素作用下(Lane 5),Bel 7402肝癌细胞 DNA构型发生变化，其缺刻构型(Formll )的比例明显增加， 表明芦荟大黄素以插入方式嵌入到Bel 7402肝癌细胞 DNA 中。

1. DNA; 2.DNA+芦荟大黄素(25 pmol/L); 3.DNA+芦荟 大黄素(50 pmol/L); 4. DNA+ 芦荟大黄素(75 pmol/L); 5.DNA+芦荟大黄素(100 pmol/L)图5;磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中芦荟大黄素对Bel 7402肝癌细胞DNA的光裂解作用(略)Fig.5; Electrophorogram of liver cancer cells Bel 7402 DNA in absenee and in presence of barbaloin in phosphate buffer (pH 7.4) solutions3;结论以上研究表明，芦荟大黄素能够以插入方式与Bel 7402肝癌细胞DNA分子发生契合契合以后，芦荟 大黄素分子对Bel 7402肝癌细胞DNA分子的结构会产生微扰，并使其由超螺旋构型向缺刘构型转化，这可能是芦荟 大黄素具有抗肿瘤作用的一个原因参考文献】; [1 ] ZONTA F ,BOGONI P,MASOTTI P,etal.Highperformanee liquid chromatographic profiles of aloe constituents and determination of aloin in beverages with reference to the EEC regulation for flavouring substances [J ] .J Chromatogr A, 1995,718:99-106.[2 ] GRuN M,FRANZ G.Untersuchungen zurBiosynthese der Aloine in Aloe arborescens Mill [ J ] .ArchPharm,1982,315:231-241.[3 ] LEMLI J.Metabolism of sennosides an overview[J ] .Pharmacology, 1988,36(Suppl.1): 126-128.[4 ] AKAO T,CHE Q M,KOBASHI K,et al.A purgative action of barbaloin is induced by Eubacterium sp.strain BAR,a huma n in testinal anaerobe of tran sforming barbaloin to Aloe-emodin anthrone [ J ] .Biol Pharm Bull,1996,19:136-138.[5 ] ISHII Y,TANIZAWA H,TAKINO Y.Studies ofaloe.V.Mechanism of cathartic effect [ J ] .Biol PharmBull,1994,17:651-653・[6 ] BROWN J P,D。