上海交大医学院细胞生物学技术考试重点.docx

一、 显微镜技术1、 分辨率（resolution）：用于表达人眼和仪器，可以辨别两点之间最小距离的标志，是衡量显微镜性能的重要指标人眼的分辨率由人眼的生理结构决定光镜由光波波长和物镜数值孔径决定电镜由电子束半波长决定分辨率极限：人眼（0.1mm）；光镜（0.2μm）；电镜（0.2nm）显微镜技术优化核心是提高分辨率，体现在两个方面：（1）光源的采用（2）样品制备和信号呈现方法使信噪比提高2、 显微镜分类：（1） 光学显微镜：普通光学显微镜；荧光显微镜（激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率荧光显微镜、活细胞荧光工作站）；相差显微镜：观测活细胞；微分干涉相差显微镜（DIC）：活细胞三维立体投影影像（2） 电子显微镜：透射电子显微镜（TEM）；扫描电子显微镜（SEM）；分析电子显微镜；高压电子显微镜；冷冻电子显微镜（3） 扫描探针显微镜：原子力显微镜3、 普通光学显微镜重要三部分：聚光镜、物镜、目镜；光源：可见光样品制备5步：固定（甲醛）；脱水（乙醇）；包埋（石蜡）；冰冻切片（1-10μm）；苏木精伊红染色（HE染色）4、 荧光显微镜光源：高压汞灯、弧光灯荧光的来源：（1）细胞和组织自发荧光（2）外源导入荧光蛋白：动态检测、活体检测、长时间检测、容易融合（3）荧光染料：吖啶橙染色DNA（绿）、RNA（橙）（4）荧光标记抗体：荧光染料与抗体共价结合（5）荧光探针：金属离子探针、细胞内pH值~、细胞内活性氧~、线粒体跨膜电位~。

5、荧光素（Fluorphore）：吸取能量后具有发光现象的物质，通常为吸取短波长的能量后发散出长波长的光，并随照射停止而消失荧光素发射光减弱（光漂白）或消失（淬灭）6、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）：以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统7、简述激光扫描共聚焦显微镜的原理（光源点,物点,像点，三点共轭）以激光作为激发光源；结构上采用双针孔装置，形成物像共聚焦的独特设计；激光通过聚光镜焦平面上针孔形成点光源，再经物镜在焦平面对样品逐点扫描样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，被光电倍增管探测器接受，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面共聚焦图像8、 激光扫描共聚焦显微镜的功能：（1）薄层断层扫描（光学切片）（2）多通道同时扫描：激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描（3）ZOOM成像：在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像4）多维度扫描：Z轴扫描（垂直）或T扫描（时间）（5）荧光定量分析9、激光扫描共聚焦显微镜技术在医学及生物学研究中的应用（1）静态：分子定位、定量分析、分子间互相作用（2）动态：分子或细胞活动的动态变化：蛋白质的移位；蛋白质互相作用的研究（FRET) ；分子运动的测量(FRAP)；离子浓度变化趋势的检测10、简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。

LSCM的优缺陷类别 LSCM 荧光显微镜 光源 激光（紫外光、可见光、近红外）短波长光源（多为紫外光）照明方式 点照明、逐点扫描落射式样本信号焦平面的样本信号，几乎无次级荧光干扰 可有多个平面的样本信号，随着相邻部位干扰图像采集系统荧光信号被PMT探测器接受实时观测，数字化图像，可以进行图像解决和定量分析照相机的原理LSCM的优缺陷： LSCM优点：（1）高水平分辨率：0.18μm（2）高垂直分辨率：沿Z轴逐层扫描（3）高灵敏度，信噪比良好（4）能定期、定位、定性、定量缺陷：（1）分辨率极限：0.15μm（2）观测厚度：50-100μm（3）逐点扫描，成像速度慢（4）伪彩色11、LSCM和电子显微镜的区别激光共聚焦显微镜电子显微镜工作原理光波的透射电子的透射成像效果微米级（荧光标记）纳米级研究目的观测分布、表达量观测细微结构12、超高分辨率荧光显微镜的原理：“突破”衍射极限，提高分辨率（50nm）（1）基于点扩展函数调制：点扩展函数变小（2）基于随机单分子定位：不会有两个靠的很近的点同时亮起来13、电子显微镜：以电子束为光源，电磁场为透镜，运用电子信号成像，具有高分辨率和放大倍数的显微镜，用于研究组织和细胞的超微结构。

14、电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性，电镜运用电子束作为“光源” 成像15、透射电子：当样品厚度小于 100nm 时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子,运用透射电子信息成像的称为透射电镜16、二次电子：在入射电子的轰击下,样品表面 5-50 nm 深度激发出来的电子称为二次电子，运用二次电子信息成像的称为扫描电镜17、TEM成像和工作原理：（1）电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子（2）带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光屏上（3）透射电子多，荧光屏亮；反之荧光屏暗，荧光屏的亮暗限度与样品微细结构一一相应，产生具有一定反差的黑白影像18、超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成 100nm 以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在 TEM 下观测组织细胞内部的超微结构19、血管灌注固定：血管灌注固定是通过血管灌注适量的固定剂，在动物体内把活细胞在原位及时固定血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响，特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要20、TEM 的样品制备（1）超薄切片技术（9步）：取材（1分钟内将新鲜标本放入固定液）；预固定（新鲜配制2.5%戊二醛）；后固定（1%锇酸）；脱水（乙醇和丙酮）；浸透；包埋聚合（环氧树脂）；修块；切片（半薄切片：500nm;超薄切片：50-100nm）；染色（甲苯胺蓝）。

2）负染色技术：通过重金属盐在样品四周堆积,加强样品外周的电子密度，烘托样品的形态和大小染色液：磷钨酸、醋酸双氧铀）（3）免疫电镜技术：是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，运用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术A、包埋前法：先免疫标记，后包埋，制备超薄切片；包埋后法：先包埋，制备超薄切片，后免疫标记；冷冻超薄切片法：将标本直接切成超薄切片，进行免疫反映，电镜观测B、推荐固定液：3～ 4％多聚甲醛 ＋ 0. 1％～0.5％戊二醛；C、规定：免疫组化结果一定要好；固定液配制要新鲜；尽快解决标本21、在样本制备过程中为什么要进行半薄切片定位？（1）选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般要小于 0.5mm2，要通过半薄切片来选取故意义的部位2）对同一部位进行光、电镜对比观测，在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有助于更确切的结识超薄切片中的结构及其互相关系22、要了解细胞内部的超微结构变化，选择哪种类型的电镜，为保证生物样品良好的超微结构，在样本取材及固定期应注意什么？了解细胞内部的超微结构变化应选择透射电子显微镜（TEM）为保证良好的超微结构，在样本取材及固定期应注意做到快、小、轻、冷。

1）快：在 1分钟内固定组织，尽也许保持其活体状态，由于瞬间的迟延都会导致细胞超微结构的变化2）小：组织块必须切成1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象3）轻：不要牵拉、锯、挤压组织要用锐利的刀片，避免细胞受到损伤4）冷：低温操作，4℃保存，减少酶的活性，避免组织发生自溶23、在透射电镜样本取材时，样本不可大于1mm3，并在1分钟以内完毕固定请问假如组织块过大会出现什么后果？没有及时固定的组织电镜下会出现何种改变？由于电镜固定液戊二醛对组织的穿透能力较弱，假如组织块过大会导致组织中心得不到及时固定，在电镜下没有得到及时固定组织细胞的细胞器会发生变性，特别是对缺血乏氧十分敏感的线粒体会出现肿胀和空泡变性等改变24、如何描述一张电镜图片1）细胞整体：大小、形状、细胞膜和突起以及细胞间的连接（2）细胞核：大小、形状、核仁、染色质等（3）细胞质：各种细胞器的数量、分布、形状等（Mit、RER、Ri、Ly、Gol…）25、TEM 在医学领域的应用（1）细胞器、组织器官的超微结构（2）原核细胞、病毒的超微结构（3）超微病理变化（病理诊断）（4）细胞成分定位（5）生物材料复合体26、扫描电镜的样品制备过程（6步）：取材（充足暴露并保护观测面：5x5mm）；清洗（用生理盐水仔细漂洗观测面）；固定（2.5%戊二醛和1%锇酸固定）；脱水（丙酮逐级脱水，醋酸异戊酯置换）；干燥：（临界点干燥）；镀膜（离子溅射镀膜或真空镀膜）27、扫描电子显微镜在生物医学领域的应用：（1）血细胞、细菌、培养细胞的整体形态、表面突起和细胞间互相关系（2）消化道,呼吸道,血管等空腔组织的表面结构 （3）植物、昆虫等（4）生物材料复合体28、扫描电镜用于观测组织表面结构，因此取材时必需要充足暴露组织表面结构，请问常用的方法和注意事项有哪些？在样品取材时必须保护好并充足暴露观测面，避免损伤要观测的部位，易卷曲的样品,如气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净，对于粘稠附着物还可以使用酶消化法。

29、请从成像信号、样品制备、图象特点和应用几方面对 TEM 和 SEM 做以比较类别TMESEM分辨率0.1nm0.6nm放大100万倍80万倍成像信号透射电子信号运用二次电子信号成像样品制备制成超薄切片等，制备过程复杂方法较简朴，标本可大而厚图像特点二维结构，平面图像三维结构图像，立体感强应用观测组织细胞内部的超微结构观测样品表面及其断面立体形貌二、细胞化学技术1、原位观测化学成分，提供的信息：（1）推测化学成分（大分子）的也许性（2）观测生理、病理状态下大分子动态变化（3）指示大分子所在的特异细胞，观测细胞在组织的分布2、细胞化学技术：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反映在细胞原位拟定化学成分的分布及这些成分在细胞活动中的动态变化的技术，用以阐明细胞化学成分、结构和功能的关系涉及酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术和原位杂交等3、细胞化学技术特点：（1）原位（保持组织细胞的天然结构）（2）细胞化学反映及可见性（3）细胞化学反映的观测：显微镜、流式4、细胞化学技术重要涉及：（1）酶细胞化学技术：1.酶+底物反映；2.显色反映显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱2）免疫细胞化学技术：1.抗原+抗体反映；2.显色反映（3）放射自显影：1.放射性同位素衰变和射线的释放反映；2.感光（4）原位杂交技术等：1.核酸杂交反映；2.显色反映5、细胞化学技术通用流程：（1）组织细胞固定（保持原位）（2）石蜡包埋或冷冻（3）切片（利于反映，利于观测）（4）化学反映（5）显色反映6、免疫组织化学、免疫细胞化学技术（IHC）：把组织细胞中的特异分子作为抗原，运用抗原抗体特异性结合的特点，用显微镜下可见的标记物直接或间接标记抗体或抗原抗体复合物，使之在显微镜下可见，从而间接地显示抗原，达成在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。

特异蛋白质定位： 1. 大分子的组织和细胞水平定位2. 细胞内大分子的固定亚细胞定位3. 细胞内大分子的转运或移位4. 细胞内定位固定的大分子的动态变化 5. 。