基因工程抗体片段.ppt

基因工程抗体片段----谱写抗体家族的新乐章基因工程抗体片段之前奏曲 ———小分子抗体第一代小分子抗体———抗原结合片段( fragment with antigen binding，Fab) 和 重组Fab• Fab 片段由完整轻链和重链的VH + CH1构成，其大小为完整抗体的1/3,约55KD；• 重组Fab 是将轻、重链可变区分别与人抗体的κ 链和重链CH1重组；Fab 基因工程构建方法及其性能• 通常是保留鼠源性的CDR区, 其余换成人源化,通 过大肠杆菌以分泌表达的方式表达L链和Fd链, 二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象 的Fab；• 该Fab具有抗体的活性因为其不含有Fc段、分 子量小、结合力高、抗原性低, 故在肿瘤治疗上 有其优越性目前已有多个片段药物获得FDA 批准上市.Fab的临床应用•1）阿昔单抗( abciximab，ReoPro) •1994 年12 月FDA 批准的第一个重组Fab 片段，该产品以血小 板糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作 为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的 成功； •2）兰尼单抗( lucentis)：治疗黄斑变性， 2006 年获得FDA 的 批准。

•3）赛妥珠单抗( cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，2008 年 获得FDA 的批准•在临床研究中，Fab 占据了临床研发抗体片段的大多数( 30 /54 种) 第二代小分子抗体———单链抗体( single chain Fv，ScFv)• ScFv指在重链V区cDNA5’端与轻链V区 cDNA5’端之间用一寡聚核甘酸连接, 在大肠杆 菌中表达成一单链多肽, 并在细菌体内折叠成 只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体 , 大小仅为完整Ig的1/6(约28KD);• 是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；ScFV的功能• 1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部位, 如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；• 2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点：多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或 药物等, 用于影像和临床治疗；第三代小分子抗体———纳米抗体和 分子识别单位( molecular recognition unit，MRU)• 1. 纳米抗体主要指仅由一个重链可变区 组成的单域抗体( VHH)，其体积约为完 整抗体的1 /10，故称为纳米抗体；纳米抗体的来源• 1993 年Hamers 等偶然发现骆驼体内存在一 • 种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体( heavy-chain antibodies，HCAbs) 。

此后，在一些软骨鱼，如护 士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体( new antigen receptor，NAR) • 这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH( variable domainof the heavy chain of HCAbs， VHH) 单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具 有良好和广泛的抗原结合力； • 克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变 区组成的单域抗体( VHH)纳米抗体单域的性质• 1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力并且由于在框架FR2 区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH 抗体在水溶液中具有良好的稳定性• 在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾病提供新的思路；• 2）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有 伸展的抗原互补结合区( CDR) 以及更高的组织 穿透性和更小的分子，VHH抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位可进入酶的活 性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利 用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体 的激动剂或拮抗剂等；• 3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经性疾病和脑肿瘤的新药VHH稳定的机制• 传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH 胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定；VHH 胚系基因序列特性• 1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现，VHH 与人源VH 基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性；• 2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。

这4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y，G49E，L50R 和W52G，，• 利用这一特点, 可以对人源抗体VH 结构域FR2 中的一些氨基酸进行VHH特征性改造, 所得到的骆驼化单域VH 抗体不仅保持原有的抗体的特异性和亲和力, 而且溶解性好、稳定性好2. 分子识别单位( molecular recognition unit，MRU)• MRU 是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，约为完整抗体分子的1/80 ～ 1 /70MRU 也具有与抗原结合的能力，且由于其穿透力强、半衰期短、显像时本底低，在临床诊 断中具有潜在的应用前景基因工程抗体片段之进行曲———抗 体片段的改造和改型• 通过对小分子抗体基因的改造和修饰，改善其亲和力、免疫原性及效应，构建出多种基因工程抗体片段.• 目前已有54 种基因工程抗体片段进入临床研究，其中30 种源自Fab ( 56%) 、19 种源自ScFv( 35%) 、5 种源自第三代小分子抗体( 9%)1.双链抗体Diabody设计背景• 由于单价抗体片段(如ScFv、Fab)与靶抗原作用后保留时间短且解离速度快, 所以在实际应用中有必要设计多价抗体分 子, 这种多价分子可显示出与抗原更加强的亲和力和慢的解离速度；• Fab和ScFv片段能够通过化学的或基因工程linker构成二聚体、三聚体或四聚体。

例如Fab就被用化学连成二价或三价的多聚体, 实验表明其与抗原的保持性有所提高；最成功的设计缩短Linker二价双链抗体ScFV0—5个氨基酸2.双特异性抗体( bispecific antibody，BsAb)一个 结合靶细胞上的特异性抗原另一个结合淋巴细胞或吞 噬细胞等效应物双特异性抗体的 2个抗原结合部位两条抗原结合臂可分别来自 FV段、Fab段、ScFV或dsFv导致效应细胞靶向杀灭 肿瘤细胞有二 价、 四价 、六 价双特异抗体的设计和运用• 化学交联：分别分离纯化两种亲本单抗，采用还原剂 使其解链，获得单价抗体，再采用异双功能交联剂， 把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联 起来；• 细胞工程：采用细胞融合的方法，将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞结合，或者使两种分泌不同单抗 的杂交瘤细胞融合；• 基因工程：多采用抗体分子片段，Fab、ScFV等经过 基因操作修饰后，通过体外组装成BsAb或者直接表达 分泌型的BsAb• A majority of both bispecific diabodies and bis-scFv are designed to bind to the CD3 T-cell coreceptor and thereby recruit cytotoxic T-cells (CTLs) to the tumor site. 双特异抗体的临床优势• 1）靶向性好：用高价BsAb 靶向目标抗原可使药物选择性地结合到高抗原密度的肿瘤组织区，正常组织抗 原密度低于BsAb 的结合域值，因而BsAb极少渗透入正常组织，从而提高了BsAb 的靶向性；。

• 实例：Lu 等设计了3 价抗ErbB2 /CD16 的BsAb，它包括2 个结合ErbB2 的ScFv 形式结合位点和一个定位于NK 细胞的单价Fab 片段位点；• 2）是一种有效的抗肿瘤策略：Michaelson 等将抗LTβR 的ScFv 片段融合于抗TRAIL-R2 单抗的重链端，设计了以TNF家族膜受体TRAIL-R2 和LTβR 为靶点的IgG 样BsAb该抗体血浆半衰期长，体外实验中能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，在小鼠肿瘤移植模型中较之亲本抗体能更显著地减小肿瘤体积；• 3）具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正常B 细胞的作用较弱：Rossi 等报道了一对来自抗CD20 IgG1κ)和依帕珠单抗( epratuzumab ) 的人源化6 价抗CD20 /22 的BsAb———20-22 和22-20它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和增殖抑制2.小分子抗体与其他分子连接 成融合物与毒素的连接• 将抗体片段与细菌或植物毒素连接, 使其具有特异性的识别肿瘤细胞的功能, 并利用毒素来杀伤肿瘤细胞；• 如Di Paolo等曾将人源化的抗Ep一CAM的单链抗体4D5MOCB与绿脓假单胞外毒素A融合, 发现其优先定位在Ep一CAM阳性的肿瘤细胞, 并能抑制多种肿瘤在裸鼠体内的生长, 显示了良好的应用前景。

与细胞因子连接• 将抗体片段与IL-2、 IL-12或GM一CSF等免疫刺激因子结合成融合蛋白后, 能刺激细胞增殖, 能促使自然杀伤细胞产生溶瘤细胞作用;其他形式的免疫结合物1）放射性标记的抗体片段：，通过抗体特异性的识别作用使放射性物质有效地导向肿瘤组织局部，用于放射免疫治疗;2）抗体-化疗药物结合物：通过化学方法使抗体和化疗药物的某些基团偶联，在特异的作用位点产生细胞毒作用进行免疫化疗;3）抗体-酶连接物：利用抗体导向作用，将催化前体药物的酶携带至肿瘤局部，待血液循环及正常组织中非特异分布的抗体酶药物廓清后再注射前体药物，在肿瘤局部造成高浓度化疗药物的微环境，从而高效率杀伤肿瘤细胞4. 细胞内抗体• 将小分子抗体基因加上定位信号序列，使其在细胞内特定部位表达，可中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或者触发免疫反应，即为细胞内抗体( intrabody).• 细胞内抗体主要应用于疾病的基因治疗细胞内抗体的应用举例• Hayashi 等成功合成了针对γ 分泌酶复合体重要成分nicastrin( NCT) 的ScFv 胞内抗体，生化分析结果显示，该抗体能扰乱内源性NCT 的正常折叠和糖基化成熟，进而影响γ 分泌酶复合体的稳定性及内源蛋白水解活性。

• 工程化的细胞内抗体为探索膜蛋白新的功能提供了重要的分子靶向工具。