鸭坦布苏病毒、鸭肠炎病毒和番鸭细小病毒TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用.docx

鸭坦布苏病毒、鸭肠炎病毒和番鸭细小病毒TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用 吴双 姜勇 徐建生 吴植 谢军 宋海港 魏若瑶 高悦 朱善元摘要：本研究旨在建立一種快速、敏感和高特异性检测鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肠炎病毒（DEV）和番鸭细小病毒（MDPV）的TaqMan三重实时荧光定量PCR（q-PCR）的诊断方法并应用于临床疑似样品检测根据DTMUV的E基因、DEV的UL2基因和MDPV的VP3基因保守区域，分别设计合成了3对特异性引物和探针，在建立单重q-PCR方法的基础上建立了三重q-PCR方法运用三重q-PCR方法对198份来自江苏和安徽的鸭组织疑似病料进行检测，结果表明，建立的TaqMan三重q-PCR可同时检测这3种病毒，检测灵敏度至少达100个拷贝，相关系数（R2）均在0.99以上，扩增效率为90%～110%同时，该方法对H9亚型禽流感病毒（H9N2 AIV）、鸭甲肝病毒Ⅰ型（DHAV-1）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、新城疫病毒（NDV）、鹅细小病毒（GPV）的检测均为阴性，表明该方法具备特异性强、灵敏度高、重复性好和快速等优点。

与常规PCR检测方法相比，三重q-PCR方法灵敏度大约高100倍临床疑似样品检测结果表明DTMUV的检出率最高，3种病毒混合感染亦常见建立的TaqMan三重q-PCR检测方法为DTMUV、DEV和MDPV的临床样品检测提供了快速、有效、特异和灵敏的工具，也为临床分子流行病学调查及定量分析奠定了基础关键词：鸭坦布苏病毒;鸭肠炎病毒;番鸭细小病毒;TaqMan实时荧光定量PCR：S834：A：1000-4440（2020）03-0626-08Establishment and clinical application of triple TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR detection method for duck Tembusu virus， duck enteritis virus and Muscovy duck parvovirusWU Shuang1，JIANG Yong1，2，XU Jian-sheng2，WU Zhi1，XIE Jun1，SONG Hai-gang1，2，WEI Ruo-yao2，GAO Yue1，ZHU Shan-yuan1（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research，Taizhou 225300， China;2.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）Abstract：This study aimed to establish a triple TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR（q-PCR） method for the rapid， sensitive and specific detection of duck Tembusu virus （DTMUV）， duck enteritis virus （DEV） and Muscovy duck parvovirus （MDPV）. Based on the conserved regions of DTMUV E， DEV UL2 and MDPV VP3 genes， three pairs of specific primers and probes were designed and synthesized respectively. Furthermore， a triple q-PCR method was established based on the establishment of a single q-PCR method. The triple q-PCR method was used to detect 198 suspected samples from Jiangsu and Anhui. The results showed that the established TaqMan triple q-PCR method could detect these three viruses simultaneously. The detection sensitivity was at least 100 copies， the correlation coefficient （R2） was above 0.99， and the amplification efficiency ragned from 90% to 110%. At the same time， the detection results of H9N2 avian influenza virus （H9N2 AIV）， duck hepatitis A virus type I （DHAV-1）， Muscovy duck reovirus （MDRV）， duck reovirus （DRV）， Newcastle disease virus （NDV） and goose parvovirus （GPV） were negative， it showed that the method had the advantages of high specificity， high sensitivity fastness good repeatability. The sensitivity of triple q-PCR method was approximately 100 times greater than that of conventional PCR assay. The results of clinical suspected samples indicated that the detection rate DTMUV was highest， and mixed infections of three viruses were also common. This triple TaqMan q-PCR assay provides a fast， efficient， specific and sensitive tool for the detection of DTMUV， DEV， MDPV and also lays the foundation for clinical molecular epidemiological investigation and quantitative analysis.Key words：duck Tembusu virus;duck enteritis virus;Muscovy duck parvovirus;TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR中国目前拥有世界上最大的水禽养殖量，在过去几十年中规模不断扩大且发展愈发快速[1]。

随着水禽养殖规模和集约化程度的发展，与之伴随的是疫病的不断增多，而水禽疫病不仅是影响水禽饲养业的头号杀手，还是水禽产业健康发展的严重桎梏其中，病毒性疫病成为水禽养殖业成功发展的最大障碍由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）感染引起的疾病称为鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE）或鸭瘟（Duck plague，DP）[2]，是雁鸭科水禽中分布最广泛且最具破坏性的传染性病毒病之一，相对较高的死亡率，包括家养鸭和野鸭[3]在内的广泛的寄主范围，使其对水禽养殖仍具有不可忽视的威胁鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）引起的鸭坦布苏病毒病是近十年出现的一种新发水禽疫病，于 2010年从中国东部沿海地区开始，逐渐蔓延至全国大部分地区[4]多个品种的鸭鹅均可感染，尤其对具有高经济效益的种鸭、种鹅和蛋鸭的危害最为明显，引起严重的产蛋下降，给鸭养殖业造成了巨大经济损失[5]番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）引起的番鸭细小病毒病主要见于三周龄内的雏番鸭，根据年龄的不同，死亡率最高可达80%[6]。

番鸭细小病毒病在中国番鸭养殖区域普遍存在，具有极高死亡率和发病率，一旦发生，会造成水禽养殖业的巨大经济损失准确迅速诊断这些疫病是开展相应防控工作的基石，q-PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、易操作、可定量分析等优点，建立单重或多重的q-PCR检测方法并应用于临床样本的鉴别诊断，不仅可分析病毒核酸在动物体内的含量，有助于临床诊断和分子流行病学调查，还可有助于病毒分离鉴定，为上述疫病的研究和防控提供技术保障1材料与方法1.1主要材料与仪器PurePlasmid Mini Kit质粒提取试剂盒购自CWBIO公司，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司，Premix Ex Taq（Probe qPCR）、Premix Taq（TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）DNA酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0 RNA/DNA提取试剂盒、PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒、EASY Dilusion（for Real time PCR）引物稀释液均购自宝生物工程（大连）有限公司。

DNA marker、E.coli DH5α购自天根（北京）生化科技有限公司，克隆载体pGEM T-easy购自Promega公司， FastPrep-24 5G高速匀浆仪购自美国MP公司，Veriti PCR仪和QuantStudio 3 Real-time PCR System均购自美国应用生物系统公司（Applied biosystems）1.2引物设计合成和毒株根据GenBank已公开发表的DTMUV E基因（GenBank登录号：AB110492.1），DEV UL2基因（GenBank登录号：JQ248597.1），MDPV VP3基因（GenBank登录号：AF166110.1）设计了3套引物和探针（表1），本研究中由于引物和探针的位置高度保守，因此并不涉及区分野毒株及疫苗株引物和探针均由英潍捷基（上海）有限公司合成DTMUV由中国农业科学院上海兽医研究所馈赠，DRV和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）由福建省农业科学院惠赠，H9亚型禽流感病毒（H9N2 AIV）由扬州大学兽医学院馈赠，DEV、鸭甲肝病毒I型（DHAV-I）、新城疫病毒（NDV）、MDPV、鹅细小病毒（GPV）为本实验室分离并保存。

DTMUV、DEV、MDPV分别为鸭坦布苏病毒、鸭肠炎病毒、番鸭细小病毒1.3核酸的提取及反转录将-80 ℃保存的组织样品剪碎，与PBS以1∶9的比例（质量比）加入到2 ml研磨管中，利用FastPrep-24 5G高速匀浆仪将组织样品匀浆，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液参照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取试剂盒说明书提取病毒RNA和DNA，并依据此方法对DH。