阅读质粒图谱的基本方法.doc

[转帖] 阅读质粒图谱的基本方法 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体 一、一个合格质粒的组成要素 a 复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点原核生物 DNA 分子中只有一 个复制起始点而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点 b 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记 （1）Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素 β 失活 第三步：看多克隆位点（MCS） 它具有多个限制酶的单一切点便于 外源基因的插入如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标 志基因的失活，而便于筛选。

决定能不能放目的基因以及如何放置目的 基因 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外 源 DNA 片段一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转 化效率越低 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位 点－转录终止信号这是用来区别克隆载体与表达载体克隆载体中加入 一些与表达调控有关的元件即成为表达载体选用那种载体，还是要 以实验目的为准绳 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 a 启动子－促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子 编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转 录的部位，但启动子本身不被转录 b 增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有 增强邻近基因转录过程的调控顺序其作用与增强子所在的位置或方向 无关即在所调控基因上游或下游均可发挥作用/沉默子－负增强子， 负调控序列 c 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体 d 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显 子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰 区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。

结构基因的最后一个外显子中 有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区， 这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的 箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的 启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体 即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程 手段送到生物细胞（受体细胞） ，需要运载工具（交通工具）携带外源 基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector） P.S.基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段 进入受体细胞的 DNA 2. 载体的分类 ―――按功能分成：（1）克隆载体 都有一个松弛的复制子，能带动外源 基因，在宿主细胞中复制扩增它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因） 的载体 （所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行 载体） （2）表达载体 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/ 翻译所必需的 DNA 顺序的载体。

―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭 载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以 运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 增 3. 基因工程载体的 3 个特点： （一）都能独立自主的复制：载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的 非必需区域，如 MCS，插在其中的外源 DNA 片段，能被动的跟着载体一 起复制/扩增，就像载体的正常成分一样 （二）都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性 基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这 些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来 4. 载体的选择和制备： 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切 位点如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达 载体 载体选择主要考虑下述 3 点： 【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载 体/表达载体 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小） 。

如 <10kb 选质粒 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达 载体 （3）对原核表达载体应该注意 3 点： ①选择合适的启动子及相应的受体菌； ②用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基 因与载体易于链接，不产生阅读框架错位 选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求： ①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷 贝数也多（也有大载体） ； ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而 严谨型质粒<10 个 ③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； ④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试 一试） 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将 载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。