引物设计原则(必看).doc

mi引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长 会导致其延伸温度大于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,也会使 错误引发机率增加3. 引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A另外，引物二聚体或发夹结构 也可能导致PCR反应失败5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰 位点或标记物4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的GC含量不能相差太大5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72E左右可使复性条件最佳Tm值的计 算有多种方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻 近法(the n earest n eighbor method)6. △值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。

应当选用3'端4G值较低(绝对值不超过9)，而5'端和中间4G 值相对较高的引物引物的3'端的4G值过高，容易在错配位点形成双链结构并 引发DNA聚合反应7. 引物二聚体及发夹结构的能值过 高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚 体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行8. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右要设计引物首先要找到DNA序列的保守区同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 ②产物不能形成二级结构③ 引物长度一般在15~30碱基之间④G+C含量在40%~60%之间⑤ 碱基 要随机分布⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补⑦引物之间不能有连 续4个碱基的互补 ⑧引物5端可以修饰 ⑨引物3端不可修饰 ⑩引物 3端要避开密码子的第3位1•引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续8个互 补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级结 构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域 用有关计算机软件可以预测 估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能（△ G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功若不能避开这一区域时，用7-deaza2 -脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的3长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp, —般为20~27mer引物的有效长度：Ln=2 （G+C）+（ A+T），Ln值不能大于38，因为＞38时，最适延伸温度会超过 TaqDNA聚合酶的最适温度（74C）,不能保证产物的特异性4. G+C含量G+C含量一般为40%~60%其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在 一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10C若按公式Tm=4 （G+C） +2 （A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80C，其Tm值最好接近72C以使复性条件最佳5. 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在尤其3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集 序列区错误引发。

6•引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免 3端的互补重叠以防引物二聚 体的形成一对引物间不应多于 4个连续碱基的同源性或互补性8•引物的3端 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰3端也不能有形 成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生 错配在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800卩mol/L dNTP（四 种dNTP各200卩mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95C，25s； 55C，25s； 72C, 1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产 物的影响是有一定规律的A : A错配使产量下降至1/20, A : G和C : C错七 下降至1/100引物A :模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的9. 引物的5端 引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大因 此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；弓I入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等 10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影 响扩增特异性与效率Hairpin发卡结构如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于 0则该结构可以干扰反应二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在 3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使Pair Rat ing匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度 下Tm低的引物决定扩增的特异性而 Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造 成错误的起始【1】引物的长度以15-30bp为宜，否则会影响扩增的特异性2】】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的 G+C含量在 40% — 60%之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+ C含量 太高，可在5'端加上一些A或T 0【3】 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的 3'端互补形成引物二聚体，避免在引物的3'端有3个G或3个C成串排列，3'端的末位碱基最好选T、 C、G,而不选A，也有建议在引物的两端用1— 2个嘌呤碱基。

4】 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5C），退火温度 根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温 度Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T）计算而对于较长的引物，Tm值需要 考虑动力学参数、从 最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应 该计算在内，我觉得有值得商讨的地方因为从理论上只有最开始的循环引物的 附加序列是不与模板链结合的，而在后来的 PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的5】引物的3'端要与模板严格配对，而5'端碱基没有严格的限制，只要与模 板DNA结合的部分足够长，其5'端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态， 这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行 双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物， 以免退火困难也要考虑引物设 计处模板的特异性PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模 板DNA序列因此，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物现在可以在这一保守区域里设计一对引物 一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对让我们先看看P1引物一般引物序列中 G C含量一般为40%~60%而且四种 碱基的分布最好随机不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在否则 P1引物设计的就不合 理应重新寻找区域设计引物同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于 4个连续碱基的互补引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点 序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大但 3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 3端开始的这里还需提醒的是 3'端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特 异性与效率综上所述我们可以归纳十条 PCR引物的设计原则:① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性② 产物不能形成二级结构③ 引物长度一般在15~30碱基之间④ G C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补⑧ 引物5端可以修饰⑨ 引物3端不可修饰⑩ 引物3端要避开密码子的第3位PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列如前述，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否对引物 的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR的成功，但遵循某些原则，则有 助于引物的设计1•引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续8个互补碱基同源2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级结构的影响，选择扩增片段时 最好避开二级结构区域用有关计算机软件可以预测估计 mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能(△ G°)小于58.6lkJ/mol时， 扩增往往不能成功若不能避开这一区域时，用 7-deaza2 -脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的3长度寡核苷酸引物长度为15~30bp, —般为20~27mer引物的有效长度：Ln=2 (G C) (A T，Ln值不能大于38，因为＞38时，最适延伸温度会超过 Taq DNA聚合酶 的最适温度(74C),不能保证产物的特异性。

4. G C含量G C含量一般为40%~60%其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度 条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10C若按公式Tm=4( G C) 2( A T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80C, 其Tm值最好接近72 E以使复性条件最佳5. 碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在尤其 3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G C富集序列区错误引发6•引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复 性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合若用人工判断， 引物自身连续互补碱基不能大于 3bp7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成 对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性8•引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰3端也不能有形成任何二级结 构可能，除在特殊的PCR （AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配在标准PC。