NK细胞制备操作规程.docx

NK细胞制备操作规程文件编号：KB-NK-035生效日期：2013.10.1版本号/修改状态：2014/2页码：第1页共2页1.目的为规范技术人员NK细胞操作，特制订本管理制度2. 范围本规程适用于科贝细胞治疗本规程适用于NK细胞制备的实验过程3. 职责实验室技术人员负责本规程的实施4. 工作程序4.1. 抽取病人外周血60ml（红盖管1管，绿盖管6管）4.2. 将红盖管里的血转入50ml离心管里，离心2000r,20min（湘仪台式低速离心机L-550,离心机升降速度均调为2）,取上层血清，并加入3P-A-L（3P-A-L浓度10%）4.3. 将绿盖管中的血加入到悬浮液中（血：悬浮液=10:1），轻轻混匀4.4. 将细胞分离液加入50ml离心管中，将4.4中的血沿着管壁缓慢加入分离液中（血：分离液=2：1）4.5. 将4.4中的血放入离心机中离心2000r，20min，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的50ml离心管中4.6. 向取出的白膜层中加入细胞洗液10ml,用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心1500r，8min（离心机升降速度可调为8），离心结束，弃上清依照上述步骤，加入6ml洗液，1500r，5min再洗一次。

4.7. 用PBS将包被好的培养瓶洗涤两次备用4.8. 向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里（血：接种液=2:1）再将4.2中处理过的血清加入培养瓶中（血清浓度10%）4.9. 将培养瓶置于37°C,5%二氧化碳培养箱培养4.10. 当细胞生长到第三天时，向培养瓶中加入NKB1和NKB2各1ml4.11. 配制培养基：每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-24.12. 当细胞生长到第四天时，向培养瓶中加入100ml4.11中处理好的培养基4.13. 以后每天观察，根据细胞悬液颜色添加培养基，每次按瓶中已有培养基等比例添加若一个培养瓶中培养物的量达到max线，则采取分瓶处理4.14. 当细胞生长到约第9-11天时，根据细胞的生长情况,转移到培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）4.15. 以后每天观察，根据细胞悬液颜色添加培养基，每次按袋中已有培养基等比例添加4.16. 约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用，觀mgNK细胞制备操作规程文件编号：KB-NK-035生效日期：2013.10.1版本号/修改状态：2014/2页码：第2页共2页同时对细胞进行质量鉴定。

将完成好的细胞悬液封好，核对病人姓名、性别、年龄、医院和质量鉴定结果等信息无误后，贴上标签，填好相应表格并签名后，送回进行回输5.记录表格:《NK细胞治疗操作流程记录表》。