兼性胞内寄生菌HLK1T对人宿主细胞的感染和持续性寄生的研究.pdf

浙江大学博士学位论文兼性胞内寄生菌HLK1对人宿主细胞的感染和持续性寄生的 研究姓名：张昆申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：胡汛20060401浙江大学博士研究生毕业论文兼性胞内寄生菌H L K l T 对人宿主细胞的感染和持续性寄生的研究摘要目前，病原菌仍是人类健康最大的威胁之一，比如急性呼吸道感染、腹泻、肺结核等疾病都是由于病原菌的感染所致而且，新的细菌感染性疾病的不断出现，以及大量致病菌的反复出现和耐药性的增加，对公众健康造成可怕的威胁因此，对潜在病原菌的发现以及病原菌致病机理的研究一直是研究的热点之一人红白血病细胞系K 5 6 2 细胞被广泛用于实验室的研究当我们对K 5 6 2 细胞进行核型分析过程中，意外地发现K 5 6 2 细胞染色标本中有杆状细菌样的结构为了排除该实验中相关实验试剂的环境细菌污染，我们严格控制了各种实验试剂和实验操作然而，多次重复实验仍得到以上结果因此，我们推论该细胞中可能存在一种细胞内生菌将K 5 6 2 细胞、R P M I1 6 4 0 完全培养基以及各种实验用试剂分别涂至基础血平板( 5 ％绵羊血) 上，置3 7 c 孵箱中培养4 8 ～7 2 小时，结果发现涂有K 5 6 2 细胞的平板上有菌落生成，而其它平板均无任何菌落形成。

经多次实验证明，平板上形成的细菌集落确为K 5 6 2 细胞来源只得注意的是，K 5 6 2 细胞能保持良好的生长状态和增殖能力，而且细胞培养基中无明显的细菌污染迹象以上初步的实验结果提示，寄生在K 5 6 2 细胞内的细菌可能是一种新的细胞内生菌，因为目前已明确的能寄生在人类细胞内的胞内寄生菌在细胞内会大量繁殖，因此感染的细胞不能健康生长由于该菌可能是一种新的胞内寄生菌，就有必要明确该菌在细菌分类中的地位，以及该菌的基本的生物学特性第一部分：H L K l 7 的分离和鉴定目的：对细菌的分类鉴定是了解其生物学功能和特性的基础为明确H L K l ’的分类地位及其基本生物学特性，该研究从人红白血病细胞系5 6 2 细胞中分离获得浙江大学博士研究生毕业论文H L K l 7 菌株并对其进行了系统鉴定方法：K 5 6 2 细胞涂哥伦比亚琼脂基础血平板( 5 ％绵羊血) ，分离获得H L K l 7 菌株，用透射和扫描电镜观察H L K lo 的形态特征，A P I 一2 0 E 试条进行生理生化特性鉴定，用A T B 药敏试条检测H L K l 7 的药敏，m ，L c 法分析H L K l l 菌株的全基因组D N A 的( G + c ) m 0 1 ％，克隆并测序1 6 Sr R N A 和g ”B 基因，用M E G A 2 软件对H L K l T 进行系统分类。

结果：H L K l l 为革兰氏阴性杆菌，长0 ．5 —2um ，宽O ．3 —0 ，5um ，无孢子形成，能运动，极性单鞭毛无发酵能力，需氧，氧化酶和过氧化氢酶阳性基因组( G+ C ) m 0 1 ％含量为7 1 ．2 ±O ．2m 0 1 ％1 6 Sr R N A 序列与肋e ，u 0 D 幻c f 盯』删属的P ，f 池扣M PF a i l 3 菌株的1 6 sr R N A 序列同源性为9 8 ％，g y r B 基因序列的同源性为8 9 ％结论：成功地从人红白血病K 5 6 2 细胞中分离获得H L K l l 菌株；H l K 1 1 为a —P r o t e o b a c t e r i a 纲P ^ g 砂胁6 口c 耙r m 用属的一个新菌种，命名为P ^ 朗y f 0 6 d c f e r m Ⅲz “c f H e “m ．s p ．n o v ，H L K l T 0 从H L K l l 的人宿主细胞来源以及a —P r o t e o b a c t e r i a细菌属性显示，H L K l l 与人类存在某种密切的关系第二部分：H L K l1 对人宿主细胞的侵袭和建立胞内寄生的研究目的：胞内寄生菌对宿主细胞的侵袭方式主要有“拉链式”和“触发式”两种，并能主动劫持宿主细胞的功能建立胞内寄生环境。

从H L K l 7 的K 5 6 2 细胞来源以及菌种鉴定结果显示，H L K l1 具有潜在的人宿主细胞胞内寄生性本研究探讨了尸胁坦∥0 6 日c f e ，f “脚z “c f ”B “mH L K l1 对不同来源的人宿主细胞s w 4 8 0 、L 0 2 和J u r k a t 细胞的侵袭和胞内寄生的机理方法：扫描和透射电子显微镜检测H L K l ’侵袭宿主细胞的方式，以及胞内寄生方式；激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白对H L K l 7 侵袭和胞内运动能力的影响；细胞免疫化学和c F u 计数检测H L K l 7 侵入s w 4 8 0 和J u r k a t 细胞的时间和浓度关系；H L K l l 基因组测序由北京华大基因研究中心完成；H L K l ’基因组的生物信息学分析，检测H L K l ’兼性胞内寄生相关的毒力因子浙江大学博士研究生毕业论文结果：H “1 1 菌能紧密粘附于s w 4 8 0 、L 0 2 、J u r k a t 细胞表面，并形成吞噬体侵入胞内热灭活的H L K l 7 失去侵袭宿主细胞的能力细胞骨架抑制剂和激光共聚焦实验显示，H L K l7 对宿主细胞的侵袭依赖予细胞骨架蛋白F —a c t i n 和微管蛋白的聚合。

透射电镜结果显示，H L K l 7 菌能在2 小时内完成对宿主细胞的侵袭并溶解吞噬体膜进入胞质，胞内寄生的H L K l ’主要存在于细胞核周围的网膜结构丰富区域同时，H L K l7 菌还具有胞间感染的能力免疫化学和c F u 计数实验显示，H L K l ’对宿主细胞的侵袭表现为时间和浓度依赖性生物信息学分析结果显示，H L K l ’基因组内含有大量编码细菌侵袭相关的基因，比如编码菌毛蛋白：p i l u sa s s e Ⅲb l yp r o t e i n ，f i m b r i a e ，c o m p o n e n t so fy p eI Vp i l u sp i l i ns u b u n i t 等，以及侵袭素和粘附素相关的蛋白：P 6 0f a m i l yp r o t e i n ，i n v a s i o np r o t e i nA ，i n v a s i np r o t e i n 等另外，还具有编码脂／酯酶相关的基因，比如编码L y s o p h o s p h o l i p a s e ，L i p N ，P h o s p h 。

l i p a s eDf a m j1 yp r o t e i n ，E s t e r a s e 等蛋白酶的基因I I L K l l 基因组中还具有编码建立胞内寄生相关的V i r B ／v i r D 4 四型分泌系统的基因，编码该系统的所有基因均在同一操纵予内H L K l l 编码的V i r B ／V i r D 4四型分泌系统与B r u c e ll a 和B a r t o n e l l a 的相应系统具有高度同源性结论：H L K l ‘为人宿主细胞兼性胞内寄生菌，能通过“拉链”方式侵袭多种来源的人宿主细胞H L K l l 对宿主细胞的侵袭过程依赖于H “r 的代谢活性，以及宿主细胞骨架的参与和重排H L K l ‘能在2 小时内完成对宿主细胞的侵袭并突破吞噬体膜进入胞浆的过程侵入胞内的H L K l ^ 集中定居在细胞核周围网膜结构丰富的区域，并能扩散和感染邻近宿主细胞H L K l l 含有大量编码细菌粘附宿主细胞表面的粘附因子，以及裂解吞噬体膜进入胞质生长繁殖的脂／酯酶，和建立胞内寄生相关的V i r B ／V i r D 4 分泌系统该研究证明了H L K l I 的胞内寄生能力，为研究细菌与人宿主细胞的关系提供了新的研究材料。

该胞内寄生特性显示，H L K l ‘具有潜在的逃避人宿主免疫并导致致病的能力浙江大学博士研究生毕业论文第三部分：皿K 1 o 对人宿主细胞的毒性作用及持续性感染能力的研究目的：胞内寄生病原菌都具备胞内生长繁殖并造成细胞或组织损伤而致病的能力有些胞内寄生菌还能转变成细菌L 型并建立对宿主的长期持续性的感染和寄生为明确H L K l 的致病能力，该研究探讨了兼性胞内寄生菌H L K r 对人宿主细胞s w 4 8 0 细胞的毒性作用，以及H L K l7 对s w 4 8 0 和J u r k a t 细胞长期性寄生的能力和方式方法：流式细胞仪( F c M ) 计数检测细胞生长能力；F c M 检测细胞周期；D N A 电泳分析D N A —l a d d e r ；透射电镜检测s w 4 8 0 细胞的死亡方式和胞内细菌的形态：c F u 计数检测H L K l ’菌在s w 4 8 0 细胞和J u r k a t 细胞内的增殖能力，以及长期性寄生能力结果：在有大量胞外H L K l ? 存在的情况下，H L K l 能显著抑制s w 4 8 0 和J u k a n 细胞的生长，抑制能力存在浓度和时间依赖性。

当H L K l 以M O I 为5 0 0 的浓度处理S W 4 8 0 和J u r k a t 细胞7 2 小时后，S W 4 8 0 和J u k a r t 细胞仍保持一定的生长增殖能力，与处理前比较分别增殖了( 6 3 ．7 5 ±1 6 ．2 5 ) ％和( 9 3 ．7 5 ±1 1 ．8 4 ) ％H L K l ‘以M O I 为5 0 0 的浓度处理s w 4 8 0 细胞7 2 小时后，能引起s w 4 8 0 细胞周期s 期阻滞，并引起细胞的调亡和坏死，其细胞死亡率为( 7 ．9 4 ±2 ．6 0 ) ％获得H “1 1长期性感染的S w 4 8 0 和J u r k a t 细胞，其生长能力和细胞周期与对照无显著差异H L K l l 能以不典型细菌与典型细菌两种形态长期存在细胞胞质内并与宿主细胞保持恒定的比例关系在获得长期性感染的J u r k a t 和S W 4 8 0 细胞内，不典型细菌的含量分别为：( 9 1 ．7 6 ±5 ．0 8 ) ％和( 6 88 ±9 ．3 7 ) ％结论：在有大量胞外H L K l ’存在的情况下，H L K l l 对宿主细胞有一定的毒性作用，能引起宿主细胞的坏死和凋亡，但宿主细胞的死亡率较低；H L K l1 能以适当比例的L 型和完整型两种细菌形式长期性寄生在人宿主细胞内；长期性感染的H L K l l 不影响宿主细胞的生长能力和细胞活力。

同时，胞内寄生菌H L K l 7的长期性寄生能力，以及含有Q —P r o t e o b a c t e r i a 菌胞内长期性寄生相关的v i r B ／v i r D 4 四型分泌系统的结果显示，H L K l1 具有潜在的长期性感染和致病的能力浙江大学博士研究生毕业论文第四部分：H L K l 7 对人宿主细胞持续性感染的机理研究目的：为建立胞内寄生环境，胞内寄生菌具有劫持宿主细胞的功能并控制细胞的生长和死亡的能力同样，胞内寄生菌也能调控自身的生长繁殖以建立长期性胞内寄生为探讨兼性胞内寄生菌H L K l ’调控自身生长繁殖以建立长期性寄生的机理，该研究从H L K l l 中克隆获得与￡盯P s c 册f 岫中的c t r A 基因高度同源的c t r Z 基因在cc 阳s c 鲫} “s 中，c t r A 蛋白作为主调控子调控多种细胞周期事件，比如D N A 甲基化，D N A 复制，鞭毛和纤毛的形成以及细胞分裂同时，在细胞周期过程中，c t r A 的含量和磷酸化活性形式均受到严格的控制当c t r A在细胞内持续高表达后，c ．c r e s 。