辅酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用.docx

    辅酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用    吴海游 吴怡 吴铁[Summary]目的 研究輔酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用方法 采用乙醇注入法制备辅酶Q10脂质体然后进行动物实验，将32只SPF级小鼠随机分成正常（CON）组、模型（MOL）组、辅酶Q10脂质体（COQ）组、二氧化钛（TiO2）组，每组各8只CON组小鼠脱毛后不作任何处理，其余组小鼠脱毛后每天涂抹相应霜剂并进行紫外线照射，其中MOL组涂抹空白霜剂，COQ组涂抹辅酶Q10脂质体，TiO2组涂抹TiO2霜剂，照射剂量为最小红斑量，实验持续8周，结束后进行小鼠皮肤病理学观察与丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、基质金属蛋白酶（MMP-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量测定结果 辅酶Q10脂质体最优处方为温度60°C、水相pH 7.7、辅酶Q10百分比0.9%、卵磷脂百分比1.6%，其包封率为44.7%，且脂质体大小均匀，成球状MOL组小鼠皮肤组织的MDA含量与MMP-1相对表达量均高于CON组，SOD含量低于CON组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的SOD含量高于MOL组，MMP-1相对表达量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织的MDA含量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的GSH-Px含量高于其他各组，差异有统计学意义（P[Key]辅酶Q10;脂质体;紫外线损伤[] R965          [] A          [] 1674-4721（2020）3（c）-0004-05Preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effectWU Hai-you1，2   WU Yi2   WU Tie2，31. Dongguan Food and Drug Inspection Institute， Guangdong Province， Dongguan   523808， China; 2. Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang   524023， China; 3. Coenzyme Q10 Joint Research Center， Guangdong Medical University-Guangdong Runhe Biotechnology Co.， Ltd.， Guangdong Province， Dongguan   523808， China[Abstract] Objective To study the preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect. Methods The coenzyme Q10 liposomes were prepared by injecting ethanol， then animal experiments were performed. A total of 32 SPF mice were randomly divided into normal （CON） group， model （MOL） group， coenzyme Q10 liposome （COQ） group， and titanium dioxide （TiO2） group， 8 mice in each group. The mice in the CON group were not subjected to any treatment after depilation， and the remaining groups of mice were smeared with the corresponding cream and irradiated with ultraviolet rays every day after depilation. Among them， the MOL group was smeared with the blank cream， the COQ group was smeared with the coenzyme Q10 liposome， and the TiO2 group was smeared with the TiO2 cream. The irradiation dose was the minimum amount of erythema， and the experiment lasted 8 weeks. After the end of the experiment， the skin pathology and the contents of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and matrix metalloproteinase （MMP-1）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in the mice were determined. Results The optimum formulation of coenzyme Q10 liposome showed as the temperature was 60°C， the water phase of pH was 7.7 and other was 0.9% of coenzyme Q10 and 1.6% of lecithin. The encapsulation efficiency of coenzyme Q10 liposome was 44.7%， and the liposome was uniform in size and globular. The MDA content and the relative expression of MMP-1 in skin tissue of the mice in the MOL group were higher than those in the CON group， and the SOD content was lower than that in the CON group， with statistically significant differences （P[Key words] Coenzyme Q10; Liposome; Ultraviolet damage辅酶Q10俗称泛醌，是机体能量ATP供应的重要有机酶[1]。

随着对辅酶Q10的不断研究，发现其在众多领域中均有药用价值，其中在皮肤老化保护方面，辅酶Q10含量可以作为衡量皮肤健康与否的重要指标[2-3]本研究前期发现三种含辅酶Q10的防晒霜具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用，这是由防晒剂与辅酶Q10联合作用的结果[4]那单独使用辅酶Q10能否达到抗皮肤紫外线效果呢？辅酶Q10作为一种大分子物质，分子量为863.36，而皮肤作为人体的第一道防线，辅酶Q10要直接透过表皮层比较困难[5-6]所以借用脂质体载体，将辅酶Q10包裹，根据脂溶性物质相似相容性原理，脂质体透过表皮层发挥辅酶Q10的作用目前已有文献报道运用脂质体载体可以将药物“运输”进真皮层发挥抗皮肤光损伤的作用[7]本研究旨在研究辅酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用，现报道如下1材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1试剂  辅酶Q10（批号：2017052405）由广东润和生物科技有限公司提供;60%大豆卵磷脂（PC60，批号：20160410）购于海爱康精细化工;胆固醇、聚山梨酯80、无水乙醇、盐酸、PBS购于国药试剂;丙二醛（MDA）测试盒（批号：201802640）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号：201712880）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（批号：201812041）、伊红-苏木精（HE）染色试剂盒（批号：201803930）购于南京建成公司;RT-qPCR反逆转录试剂盒（批号：201705467）与SYBR荧光染料购于TaKaRa公司。

1.1.2仪器  PCR扩增仪（Thermo公司）;UVB紫外灯及ST-513型紫外线辐照计（台湾先驰光电公司）;电子天平（上海民桥）;雷磁实验室pH计（上海精密仪器公司）;200 kV场发射透射电子显微镜（Tecani G2 F20 S-TWIN型）;酶标仪（中国普朗公司）;微量移液器（美国Thermo公司）、冷冻离心机（德国eppendorf公司）1.2辅酶Q10脂质体的制备首先按一定比例精确称取辅酶Q10、PC60、胆固醇、聚山梨酯80、无水乙醇，55°C水浴搅拌20 min至完全溶解得到油相;再配制PBS溶液，作为水相，并于55°C恒温磁力低速搅拌，待油相搅拌完成后，用注射器将油相快速注射入水相中，并将水相搅拌速度提升至1000 r/mim、温度不变搅拌20 min，搅拌完成后即用显微镜观察是否有脂质体生成，将得到的脂质体溶液自然冷却到室温，保存在合适条件下[8]1.3包封率（encapsulation efficiency，EE）计算标准溶液的配制：准确称取辅酶Q10标准品10.00 g，溶解于无水乙醇中，并置于50 ml容量瓶中定溶，计算标准品溶液在300 nm波长处的吸光度值，多次测量求出平均值;样品处理：把制得的样品在4℃ 8000 r/min离心30 min，再取少量上清液用微孔滤膜过滤，这使得滤液中不含脂质体，用无水乙醇稀释滤液，最后在300 nm波长处测量稀释液的吸光度值，根据标准品吸光度值计算EE。

1.4正交处方优化以EE为考察标准，以制备温度（A）、水相pH值（B）、辅酶Q10百分比（C）、PC60百分比（D）4个因素作为考察因素进行正交处方优化，每个因素设置3个水平，按L9（34）正交表进行正交实验设计（表1）1.5实验动物造模32只SPF级3月龄雌性KM小鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，体重（27.41±0.57）g，动物合格证：SCXK（粤）2011-0015，各小鼠均自由饮食实验开始前，将小鼠背部皮肤进行物理脱毛，面积约为2×3 cm2，再随机分成四组，即正常（CON）组、模型（MOL）组、辅酶Q10脂质体（COQ）组、二氧化钛（TiO2）组，每组各8只正常组小鼠脱毛后不作任何处理，其余组小鼠脱毛后每天涂抹相应霜剂并进行紫外线照射，其中MOL组小鼠涂抹空白霜剂，COQ组小鼠涂抹辅酶Q10脂质体，TiO2组小鼠涂抹TiO2霜剂，照射剂量为最小红斑量[9]，连持8周[10-11]，每周称量体重1次，实验结束后小鼠眼球取血处死，剪下皮肤进行指标检测1.6小鼠皮肤组织MDA、SOD、GSH-Px的测量实验结束后，剪取3 g左右皮肤组织放进匀浆管中加入适量生理盐水进行冷冻匀浆，待组织块充分匀浆后4℃ 12 000 r/min 离心15 min，取离心管上层液，参照试剂盒提供的检测方法对小鼠皮肤MDA、SOD、GSH-Px进行检测，并计算其含量。

1.7小鼠皮肤病理学切片染色实验结束后，剪下小鼠背部脱毛部位皮肤进行多聚甲醛固定、石蜡包埋，再进行HE染色，染色方法详细参照染色试剂盒说明书1.8小鼠皮肤组织基质金属蛋白酶（MMP-1）表达水平的检测实验结束后，剪取3 g皮肤组织用Trizol进行匀浆，提取组织RNA，再参照RT-qPCR反逆转录试剂盒方法进行RNA转录，最后在SYBR荧光颜料的作用下PCR扩增仪进行基因相对表达量检测[。