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基因工程常用得工具酶基因工程常用的工具酶限制性核酸内切酶：简称限制酶 是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶20世纪50年代发现：噬菌体E.coliBPFU10-4E.coliBPFU1噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coliB限制性核酸内切酶：降解外来DNA防御修饰酶：DNA甲基化保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！一、限制酶的种类限制修饰活性酶蛋白结构相对分子质量切割位点切割作用辅助因子实用性代表型酶型酶型酶同时存在单独存在同时存在多亚基结构单亚基结构两个亚基30万dal2-10万dal、之间与识别位点不一致与识别位点一致与识别位点不一致Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、SAM低高低EcoK、EcoBHindEcoP二、限制酶的命名命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种菌株名位于其后罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统HaemophilusinfluenzaedHind、Hind、Hind属名种名株名不同限制修饰系统三、型限制酶的特性-识别序列识别双链DNA分子中特定的4-8对核苷酸序列5GCTGAATTCGAG33CGACTTAAGCTC5EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点5GAGGCCGAG33CTCCGGCTC5Hae的识别序列Hae的切割位点大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列5GCGTPyPuACGAG33CGCAPuPyTGCTC5Hind的识别序列PydCMP、dTMPPudAMP、dGMP识别序列呈典型的旋转对称型回文结构5GCTGAATTCGAG33CGACTTAAGCTC5EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的DNA双螺旋结构三、型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5GTGAATTCGA33CACTTAAGCT5EcoRI5GTGAATTCGA33CACTTAAGCT5平齐末端：5GAGGCCGAG33CTCCGGCTC55GAGGCCGAG33CTCCGGCTC5Hae彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端三、型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性末端的一类限制酶5GTGGATCCGA33CACCTAGGCT5BamHI5GTGGATCCGA33CACCTAGGCT55GTTGATCAGA33CAACTAGTCT5BclI5GTTGATCAGA33CAACTAGTCT5BamHI、BclI为一组同尾酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5GTGATCGA33CACTAGCT5Sau3AI5GAGATCCA33CTCTAGGT5MboI5GTCCCGGGGA33CAGGGCCCCT5XmaI5GTCCCGGGGA33CAGGGCCCCT5SmaI四、影响限制酶活性的因素DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间DNA的甲基化程度：反应温度：DNA的分子结构：酶缓冲液组成：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：第二节DNA连接酶DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3羟基与5磷酸基形成磷酸二酯键的酶作用特点只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子；DNA链上必须具有游离的3-OH和5-P；只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成的裂口；需要吸能：ATP/NAD+连接方式缺口DNA:平齐末端DNA：粘性末端DNA：5533OHP5533OHPPOH5533基因工程中常用的连接酶T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶）大肠杆菌DNA连接酶热稳定性DNA连接酶第三节DNA聚合酶DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶作用特点能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）引物链：带有3-OH游离基团模板：单链或双链DNA模板Mg2+：一、大肠杆菌DNA聚合酶（DNApolI）酶特性：53聚合酶活性53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性3G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A5dNTPMg2+DNApolI3G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A55C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5C-G-A-G-T-OH切口平移反应（Nicktranslation）用途：制备32P标记的DNA探针53核酸外切酶活性53核酸聚合酶活性5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A55G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A55G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5DNaseIDNApolIMg2+dNTPa-32P-dATP二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一个片段：53核酸外切酶活性另一个片段：53聚合酶活性、35核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：53聚合酶活性35核酸外切酶活性Klenow大片段酶用途：补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5KlenowdATPdTTP5G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C5用32PdNTP对3凹端进行末端同位素标记5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5Klenowa-32P-pppdAdTTP5G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C5cDNA克隆中，合成cDNA第二链应用sanger双脱氧末端中止法进行DNA测序三、TagDNA聚合酶来源嗜热水生栖热菌酶特性53聚合酶活性、35核酸外切酶活性耐高温：7580应用：PCR技术（聚合酶链式反应）PCR技术基本原理：类似于细胞内DNA复制过程基本步骤(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的扩增(a)53引物13535引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5335引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）PCR反应示意图(e)(f)(g)94变性（1min）60退火（1min）72延伸（1.5min）温度（）时间（min）947260循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期特点待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间待扩增DNA链得到迅速大量扩增反应体系组成影响因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的设计退火温度MgCl2浓度第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP随机加于DNA分子的3-OH端5p3HOOH3p5TDTMg2+dATPAAAAAAAAAAAAOH35p3HOp5同聚物尾巴Poly（dA）作用底物：带3-OH末端的单链DNA5pOH3TDTMg2+dATPAAAAAAAAAAAAOH35p带3-OH单链突出末端的双链DNA5p3HOOH3p5TDTMg2+dATP5p3HOAAAAAAAAAAAAAAOH3p5带3-OH平齐末端的双链DNA5p3HOOH3p5TDTCo2+dATP5p3HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3p5用途：外源DNA与载体的重组DNA片段3端标记二、碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠作用：催化核酸分子脱去5-P5pOH3DNAorRNA5pppdNTP5pppNTPBAP/CIPOH35HO5HOdNTP5HONTP用途：防止载体自身环化5端标记时去磷酸化三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）特性：催化-P从ATP分子转移给DNA/RNA的5-OH端作用：5端同位素标记5HO3HOOH3OH5T4-PNPMg2+pppATP（g-32P-ATP）5p3HOOH3p5结束 4Word版本。