辣椒ASR基因的克隆与表达分析.docx

    辣椒ASR基因的克隆与表达分析    蔡小桃 张颖 韦丽丽 徐小万 谢炳春 庄泽岳 吴智明辣椒ASR基因的克隆與表达分析蔡小桃1，张 颖1，韦丽丽1，徐小万2，谢炳春1，庄泽岳1，吴智明1*（1仲恺农业工程学院园艺园林学院，广州 510225;2广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640）摘要：【目的】克隆辣椒ASR（ABA-stress-ripening）基因进行生物信息学分析并探究其在不同组织和非生物胁迫处理下的表达模式，为深入研究ASR基因家族在辣椒果实发育和逆境胁迫中的作用机制提供参考方法】以遵辣1号辣椒为材料克隆其ASR基因，对该基因家族成员进行生物信息学分析和系统进化分析，运用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及在ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下的表达模式结果】克隆的2个辣椒ASR基因分别命名为CaASR2和CaASR3，基因全长分别为987和938 bp，最长开放阅读框（ORF）分别为333和339 bp，分别编码110和112个氨基酸，蛋白分子量分别为12.45和12.73 kD，理论等电点（pI）分别为7.47和6.50，均为亲水性蛋白。

结合前人克隆的辣椒CaASR1基因分析，结果显示，CaASRs预测位于细胞核，均含有ABA/WDS特征结构域;基因结构分析结果显示，辣椒ASR基因均含有2个外显子和1个内含子，启动子区域均包含ABA响应元件ABRECaASR1、CaASR2和CaASR3氨基酸序列分别与番茄（Solanum lycopersicum）基因组中的ASR蛋白氨基酸序列NP_001269248.1（80.20%）、NP_001307920.1（91.30%）和NP_001234137.1（96.43%）有非常高的相似性，表明其进化的相对保守性3个ASR基因在辣椒花中表达量最低，在根、茎、叶和种子中表达量中等，但均随着果实的发育表达量逐渐升高，特别是在转色和成熟果实中ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下，基因的表达量均显著升高（P<0.05），其中以CaASR3响应最快，且上调表达量高于其他同源基因结论】辣椒基因组中3个ASR基因具有ASR基因家族的典型特征，并在辣椒不同组织和非生物胁迫响应中发挥重要作用关键词： 辣椒;ASR;果实发育;非生物胁迫;基因表达： S641.3                         文献标志码： A ：2095-1191（2021）11-3049-10Cloning and expression analysis of ASR genes in pepper（Capsicum annuum L.）CAI Xiao-tao1， ZHANG Ying1， WEI Li-li1， XU Xiao-wan2， XIE Bing-chun1，ZHUANG Ze-yue1， WU Zhi-ming1*（1College of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou510225， China; 2Vegetable Research Institute/Guangdong Key Laboratory for New Technology Researchof Vegetables， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou  510640， China）Abstract：【Objective】ASR（ABA-stress-ripening） genes were cloned in this study. By bioinformatics analysis and expression analysis under different tissues and abiotic stress treatments， to provide a reference for further study on the mecha-nism of ASR gene family in pepper fruit development and abiotic stress. 【Method】ASR genes were cloned from Zunla-1 cultivar. A series of bioinformatics and phylogenetic analysis were carried out to evaluate the family members. The tissue specific expression patterns and the expression patterns under ABA， high temperature， high salt， and drought stress were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Two ASR genes were cloned， named as CaASR2 and CaASR3. The full lengths of CaASR2 and CaASR3 were 987 and 938 bp， and the open reading frame（ORF） were 333 and 339 bp in length， which encoded 110 and 112 amino acids， respectively. Their molecular weights were 12.45 and 12.73 kD， and their theoretical isoelectric points（pI） were 7.47 and 6.50， respectively， and they were hydrophilic protein. The results showed that CaASRs were predicted to be in the nucleus and contained ABA/WDS（ABA/water deficit stress） domain. All CaASRs genes contained two exons and one intron， and the promoter region contained ABA response element ABRE. The amino acid sequences of CaASR1， CaASR2 and CaASR3 were highly similar to  those of ASR protein amino acid NP_001269248.1（80.20%）， NP_001307920.1（91.30%） and NP_001234137.1（96.43%） in tomato（Solanum lycopersicum）， which indicated the relative conservation of evolution. The results of tissue specific expression analysis showed that they were expressed the lowest in flower， and the moderate in root， stem， leaf， and seed， gradually increased with fruit grew， and especially highly expressed in color-changing fruit and mature fruit. The expression levels were significantly increased under ABA stress， high temperature， high salt and drought（P<0.05）， and CaASR3 had the fastest response， whose up regulated expression levels were higher than that of other homologous genes. 【Conclusion】Three ASR genes in pepper genome have typical characteristics of the ASR family and play important roles in different tissue and abiotic stress resistance in pepper.Key words： pepper（Capsicum annuum L.）; ASR（ABA-stress-ripening）; fruit development; abiotic stress; gene expressionFoundation item： National Natural Science Foundation of China（32072598）; The Characteristic Innovation Project of Colleges and Universities in Guangdong（2018KTSCX099）0 引言【研究意义】辣椒（Capsicum annuum L.）富含维生素C和辣椒素，营养价值极高，品种资源丰富，栽培适应性广，在保证我国蔬菜周年均衡供应、农民增收与脱贫致富中发挥了重要作用。

2018年我国辣椒播种面积已达213.3万ha，年产值约2500亿元，是我国栽培面积最大和经济效益最高的蔬菜作物之一（邹学校等，2020）由于栽培范围广，加上近年来气候的剧烈变化，高温、干旱及土壤盐渍化等逆境严重影响了辣椒栽培生产，带来巨大损失ASR（Abscisic acid-，stress- and ripening-induced）蛋白是一类植物特有的亲水性蛋白，在植物的生长、发育与逆境胁迫响应中发挥重要作用（González and Iusem，2014）克隆并深入研究ASR基因的特征、进化和表达模式，对辣椒丰产和抗逆性改良具有重要意义前人研究进展】ASR基因家族是从种子植物进化而来，首次在番茄果实中被鉴定（Iusem et al.，1993），随后在单子叶和双子叶植物均有发现ASR蛋白，海岸生长的盐生植物海蓬子（Salicornia brachiata）也鉴定出含ASR基因（Jha et al.，2012），这些同源基因主要受水分亏缺、盐胁迫、激素脱落酸（ABA）、低温和光强的调控在不同物种中，ASR基因的数量不同，如水稻（Oryza sativa）ASR基因家族有6个已知成员（Philippe et al.，2010），番茄（Solanum lycopersicum）有5个成员（Frankel et al.，2006），葡萄（Vitis vinifera）仅1个已知成员（Çakir et al.，2003），玉米（Zea mays）则多达9个成员（Virlouvet et al.，2011）;而在十字花科植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中缺失（Carrari et al.，2004）。

研究发现，ASR蛋白大多包含2个高度保守的区域：N端富含6～7个组氨酸残基区域，C端约70个氨基酸残基和核定位。