放射自显影教学课件.ppt

放射自显影核医学教研室n定义：放射自显影是一种利用放射性核素发 射的射线，使乳胶中的卤化银感光而形成潜 影，经显影和定影，形成图像借助感光银 颗粒所在的部位和强度，通过影像分析，能 准确地判断放射性示踪剂的分布部位和数量 （半定量），这种技术称为放射自显影术（ autoradiography）这种技术得到的图像称 为放射自显影像（autoradiogram），以上两 种术语均可简称为放射自显影（ARG）第一节 基本原理一、潜影的形成和消退 二、类型 三、常用的感光材料 四、常用的放射性核素 五、照相处理 六、放射自显影的分辨力 七、放射自显影的本底、效率一、潜影的形成和消退n（一）潜影形成的原理n放射自显影原理与光学摄影原理基本相似 乳胶中的每颗溴化银晶体都是由Ag+和Br- 的点阵构成在制作过程中，点阵存在缺 陷，这些缺陷即是潜影形成过程中的敏化 中心射线与乳胶相互作用，引起电离作 用，使Ag+还原为Ag原子，形成潜影潜影形成步骤1、发射电子：核射线与溴化银作用，使其电离，射 出电子，向敏化中心移动形成阴电层AgBr+β粒子→Ag++Br-+e-2、 Ag+的还还原：Ag+向敏化中心移动，与e-结合，还 原成银原子。

e-+Ag+ →Ag3、潜影形成：还原的银原子起催化作用，致周围的 Ag+被还原，形成潜影Ag ……Ag →nAg潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像二）潜影的消退n有潜影形成的结晶在显影液的作用下，溴 被洗去，银原子则留下来成一个黑色颗粒 潜影如未及时显影，则在水、氧等作用 下还原的银原子会减少，使潜影消退故 曝光应在干燥、低温、少氧的环境下进行 二、放射自显影的类型n（一）宏观自显影（macroscopic ARG） ：又称大体自显影，观察范围较大，分辨 力低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据 黑度判断示踪剂的分布及相对数量此种 自显影适用于小动物的整体标本，大动物 的整个脏器或肢体，以及层析板、免疫沉 淀板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等的研究 n（二）显微镜自显影（light microscopic ARG）：又称光学显微镜自显影，是借助显 微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较 高根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数 量的多少适用于组织切片、细胞涂片等标本 的研究可以对不同细胞进行比较，并根据不 同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的 代谢过程制备一般采用液体乳胶法n（三）电子显微镜自显影（electron microscopic ARG)：用于示踪剂在亚细胞结构 中分布情况的研究，能显示出普通显微镜观 察不到的细微结构与放射性核素分布的关系 。

适用于细胞超微结构，甚至大分子（DNA 、RNA）上的精确定位和定量，也可观察动 态过程此类技术要求标本在100nm以下的 超薄切片，乳胶厚度仅相当银颗粒的直径（ 约140nm）三、常用的感光材料n放射自显影常用的感光材料包括各种类型 的原子核乳胶、X线胶片、电影正片、氚片 或幻灯片一）原子核乳胶n简称核乳胶，由溴化银和明胶组成常温 上呈半固体，低温为明胶状，温度升至 40℃左右为液态使用时乳胶涂层厚度可 由乳胶量和稀释度（用去离子水稀释）进 行调节n液体乳胶直接涂在标本或支持物上，多用于 光镜和电镜自显影将液体核乳胶涂在玻片 上，可抽成核乳胶干板（nuclear emulsion plate），再于标本接触形成自显影像，多用 于光镜自显影或宏观自显影也可将干板将 乳胶层从玻片上揭下来，称为揭膜核乳胶（ stripping film emuslon），多用于定量的光镜 自显影n由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗 粒平均直径1μm，对低能β射线敏感度高， 对暗室的安全光也有相当耐受乳胶涂在 醋酸纤维素酯片基的单面，乳胶面没有保 护层使用时要注意保护乳胶层面，该面 直接与标本接触，以获得最佳灵敏度。

主 要用于3H标记化合物的宏观自显影或低倍 光镜自显影二）氚片（tritum film）（三）X线片（X-ray film）n由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒 直径2.5μm，对射线分辨率较低，对暗室内 的安全光有一定的耐受乳胶涂在醋酸纤维 素酯两面，外覆保护层主要用于核素射线 能量较高的宏观自显影或低倍光镜自显影四、常用的放射性核素n选择放射性核素应考虑其射线种类、能量和半衰期核素 半衰期 射线类型 射线平均能量（MeV）3H 12.33年 β 0.00514C 5730年 β 0.0532P 14.28天 β 0.69535S 87.4天 β 0.05545Ca 165天 β 0.1059Fe 44.6天 β 0.12125I 60.2天 β、γ 0.0037五、照相处理（一）显影和定影 （二）显影液和定影液 （三）干燥、染色和封固（一）显影和定影n感光材料与标本接触后，经射线的作用溴 化银晶体形成潜影，未受核射线作用的溴 化银则不形成潜影。

这两种晶体经显影和 定影，才能将其区分显影的作用是使银 盐还原，有潜影的结晶比无潜影者显影快 ，因此适当控制显影时间可只使受照射的 结晶呈现黑色颗粒，定影的作用是洗去未 感光的银盐二）显影液和定影液n显影和定影是由显影液和定影液来完成的 常用的显影液为D-19b，定影液为F-5 显影液和定影液的温度应严格控制在 19±1℃，显影时间2-4min显影结束后用 水充分漂洗，然后进行定影定影时间4- 8min，经水充分冲洗后晾干显影和定影 的具体时间可通过实践选定nD-19b显影液和F-5定影液配方D-19b显影液配方 F-5定影液配方水（5℃）(ml) 700 水（5℃）(ml) 800米吐尔（g） 2 硫代硫酸钠(g) 240 无水亚硫酸钠(g) 72 无水亚硫酸钠(g) 15对苯二酚（g） 8.8 28%醋酸(ml) 48无水碳酸钠(g) 48 硼酸(结晶)(g) 7.5溴化钾(g) 4 钾矾(g) 15加水至(ml) 1000 加水至(ml) 1000（三）干燥、染色和封固n经显影、定影和冲洗等处理的乳胶可空气 或人工干燥，但干燥过程应避免尘粒沾污 乳胶，也可用酒精进行脱水干燥。

干燥后 可按常规方法染色（如苏木精-伊红），染 色后可用盖坡片封固六、放射自显影的分辨力n放射自显影的目的在于研究放射性核素或其 标记化合物在组织内的位置，所以放射自显 影的分辩力，主要是指位置的分辩力故分 辨力就是指两个相邻的放射性核素分子在标 本中的距离近以多少能在显影银颗粒上显示 为两个颗粒银颗粒 显影放射源可分辨不可分辨n半距离（half distance，HD）衡量分辨力常用半距离来表示 即一线性放射源，其显影的银 颗粒分散在放射源的两侧，银 颗粒随着与放射源的距离的增 加而减少，当银颗粒减少到一 半时，此距离称半距离若放 射源为点状源则以半半径来表 示HDn影响分辨力的主要因素：n1、核素的能量：核素的能量越高，射线的 射程较长分散的银颗粒就较多，因而分辨 力下降如在相同条件下，3H、14C、32P的 自显影分辨力依次下降射线能量低的自显影射线能量高的自显影n影响分辨力的主要因素：n2、样品的厚度：样品厚，组织表面和深层 中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒 分散程度加重，影像重叠，分辨力下降样 品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长薄样品自显影厚样品自显影n影响分辨力的主要因素：n3、乳胶层的厚度：较薄的乳胶层记录的是 离放射源最近的径迹起始部，随乳胶加厚， 记录的包括径迹起始部和远离放射源的部分 ，偏离放射源的机会越多，分辨力下降。

乳胶层厚，形成较大的影像n影响分辨力的主要因素：n4、样品与乳胶层的间隙：距离大者，射线 散射面积也大，影像越不清晰，分辨力下降 样品与乳胶层间隙大，形成较大显影n影响分辨力的主要因素：n5、乳胶银晶体大小：显影银颗粒不一定于 原有的卤化银位置完全一致，故银晶体越小 ，则显影银颗粒越小，分辨力就越好n6、曝光时间：正常曝光时间，核素中占多 数的中、低能量射线作用于乳胶，分辨力高 时间过长，则高能射线作用乳胶几率增加 ，散射加大，分辨力下降n7、显影时间：显影时间长，可使一些未感 光的银粒被还原，使影像界限不清，分辨力 下降七、放射自显影的本底、效率n1、本底：在自显影上，除标本内的放射性核 素外，由其他原因造成的显影颗粒，统称自 显影的本底本底过高不仅对低水平放射性 的测量，而且降低分辨力n暗室红灯过量或感光材料在红灯下曝露时间 过长、显影液温度过高或时间过长、感光材 料过期或保存温度过高、感光材料的机械弯 折或涂液体乳胶干燥过快以及感光材料沾污 还原性物质等，是引起自显影本底过高的常 见原因n自显影的效率：系指待测标本中的放射性 核素在曝光时间内，每100次衰变所给出的显 影银粒数目。

n粗略估计，当3H标本的厚度为1μm、密度为 1.1时，光镜自显影中的效率为10%~15%， 而厚度为5 μm者，效率则为4% ~5%（很多 深层β粒子不能从标本中射出）32P标本在 同样条件下的效率为30% ~40%，在电镜自 显影中，3H的效率为25%第二节 放射自显影的基本方法 及结果分析n医学生物学示踪研究中的自显影实验，一般环 节是：1、示踪：向实验动物或离体标本引入 放射性核素标记物2、标本制备：取生物标 本并制备成含放射性核素的切片、涂片或电泳 、层析分离的标本3、自显影制备：暗室中 在标本上敷加感光材料4、曝光：避光条件 下核射线作用于感光材料5、照相处理：显 影、定影、水洗、干燥、染色、封固最后是 阅读分析一、示踪剂引入的方法n（一）引入途径n（二）引入方法n（一）引入途径n1、体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹 腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性 标记化合物n2、体外实验：对组织、细胞、体液的培养 过程，则可在培养瓶中引入在离体标本上 研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直 接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余 的示踪剂后再进行自显影二、放射自显影的标本制备总要求：标本制备过程不能引起示踪剂的流 失或移动。

（一）组织切片 （二）整体小动物或大动物脏器切片 （三）牙齿、骨骼 （四）体液、培养液中的细胞或其他成分 （五）电镜标本 （六）无细胞的标本n（一）组织切片n1、冰冻切片：标本采集后不经固定，直接快速 冷冻冰冻的标本不能反复冻融，直接放置-80℃备 用然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后 置4℃进行自显影适用于扩散性示踪实验和需保存 生物活性的实验n2、石蜡切片：标本经固定液固定（福尔马林、 多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡 包埋等过程，常温下切片标本不宜用含重金属盐 的固定液，防止干扰结果固定后必须充分水洗。