多聚乙烯亚胺介导基因转染的体外研究试验.doc

多聚乙烯亚胺介导基因转染的体外研究试验7 *赵梦丹，杨峰亮1陈坚、虞和永(1.浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江杭州310006； 2.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100) 摘要：目的考察并确定多聚乙烯亚胺(PET)最佳的体外细胞转染条件，评价PET作为基因 转染试剂的可行性方法以MTT法检测不同分子量PEI的细胞毒性以PEI为载体，在不同的N/P 比值的条件下，将绿色荧光蛋白基因导入人II型肺上皮A549细胞，以荧光显微镜及荧光分光光 计系统检测其转染效率结果分子量为25 Kdo的PEI,当时，其转染效率最高 结论PEI是-种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体，可应用于体内外基因治疗关键词：基因递送；多聚乙烯亚胺；基因转染；pEGFP-C3；人II型肺上皮A549细胞Polyethylenimine as a Nonviral Vector for Gene TransferZHAO Meng-Dan1, YANG Feng-Liang1, CHEN Ji an2, YU He-Yong1*(1・Womens Hospital School Of Medicine Zhejiang University, Hangzhou310006;2. Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo 315100 )Abstract： Objective To investigate the best condition of polyethylenimine(PEI) for gene transfer to A549 cells. Methods Evaluate the cytotoxicity of PEI by Mononuclear cell direc cytotoxicity assay(MTT). Tn different conditions, using PEI as the vector, A549 cells were transfected with fluorescent protein (pEGFP-Cl) gene and lue if erase gene. Expression efficiency of the transduced gene was monitored by fluorescence miceoscopy and fluorescence assay system. Results PET had low cytotoxicity, when N/P ratio equaled to 7. 5, the transfection efficiency of PEI was highest. Conclusion PEI is an inexpensive, low cytotoxicity and high efficiency vector. It can be widely used in the area of gene therapy.Key words: Non-viral vcctor;PEI; Transfection efficiency; pEGFP-C3； A549基因治疗是以基因转移为基础，将外源基因导入人体，达到治疗目的的一种治疗方法。

目 前基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因导入系统一•般地,基因导入系统可分为病毒载 体(viral vector)系统和非病毒载体(non-viralvector)系统病毒载体充分利用了病毒高度进化所具 有的感染和寄生特性而被广泛有效地应用但目前研究应用的病毒载体仍存在诸多不足，如免 疫原性高、毒性大、目的基因容量小、制备较受杂及费用较高等以阳离子脂质体、阳离子聚 合物为代表的非病毒载体，由于其安全性能、易于大规模制备等的优越性，在基因治疗应用中备受瞩目〔七多聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是一种新近合成的非脂类阳离子多胺多聚体它作 为一种新的非病毒基因转染载体，是目前研究的热点PET的终末基基在pH 6.9时离子化，而内部基基则在pH 3.9时离子化，有强大的缓冲能力， 因此能抑制晚期内吞小泡的酸化，并因此导致肿胀，引起内吞小泡膜的破裂并释放其中的DNA, 即“质子泵”原理⑵按照“质子泵”原理，PEI阳离子聚合物，在不需要吞噬泡或溶酶体溶解剂的情况下，能 显示出较好的基因转染效果⑶本研究就是通过检测PEI的细胞毒性以及在不同条件卜甲曰的转染效果，来确定PEI最佳的转 染条件，评价PEI作为转染试剂的可能性，为在国内推广使用提供可靠的依据。

1材料和方法1.1材料与仪器多聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI,分子量分别为25Kda, Sigma Chem., St.Louis,USA)将PEI溶于PBS中，制成1. 1 mg/ml的储存液，用1 mol/L的HCL调PH值至7. 0,经0. 22pm 的微孔滤膜除菌，4C保存备用绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-C3(浙江省第一医院呼吸内 科赠送)；细胞裂解液(Promega, Madison, IL, USA)； Lipofectamine™2000 转染试剂盒 (Invitrogen, USA)；质粒提取试剂盒(Free Qiagen,Valencia,CA, USA)；人 II 型肺上皮A549细胞 (中科院上海细胞研究所)；大肠杆菌菌株DH5 (浙江省第二医院肿瘤研究所保存)；细胞培养 基DMEM(杭州四季青生物工程材料有限公司)；新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公 -司)；荧光素酶检测全套试剂购(Promcga)其他溶剂和试剂均为分析纯微粒粒度与表而电位测定仪(3 000 HS,Malvern UK)；荧光分光光度仪(F-4000, HITACHI,Japan) ； 24孔培养板(Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA)；荧光倒置显微镜 (DMIL, Leica Microsystems Ltd, Germany)；酶联免疫检测仪(BioRad, Model 680, USA)；高 速离心机(3K30,Sigma ,Germany): CC^Tli温培养箱(Sanyo, Japan):恒温磁力搅拌器(85・2型，上 海司乐仪嘴厂)：电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2质粒的扩增与提取将带有pEGFP-Cl的大肠杆菌菌株接种于LB培养基(含50 丁胺卡那)，37C, 300rpm, 摇菌培养至饱和状态(OD600Q4) o然后按质粒提取试剂盒说明操作，制备质粒DNA,并用琼 脂糖凝胶电泳鉴定样品DNA使用紫外分光光度计法进行定量，并用260 nm与280 nm吸光度的 比值(A260nm/A280nm)来评价其纯度，实验用DNA样品要求比值大于1.751.3 PEI/DNA纳米粒凝胶阻滞分析通过改变制备纳米粒时加入PEI溶液的浓度来制备不同N/P （PEI所含N和质粒所含P的摩尔 比）的PEI/DNA纳米粒混悬液分别取含等量的裸质粒溶液和N/P分别为0, 0.5, 2.5, 5.0, 7.5, 10 ,15, 20的PEI/DNA纳米粒混悬液进行质量浓度为1%的琼脂糖凝胶水平电泳实验囹1.4 PEI/DNA纳米粒理化性质取PET/DNA纳米粒分散液适量，以微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定其粒径1.5 A549细胞的培养取人II型肺上皮细胞A549,在含有10 %小牛血清培养液中连续培养（5 %CC）2、37笆孵箱） 取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔2X105个细胞的密度接种24孔培养板， 孵箱内预培养24小时。

1.6 PEI/DNA纳米粒体外转染及荧光显微镜观察转染前24小时内，将A549细胞按2X10》孔接种于24孔细胞培养板中，置37C、5%CC）2细胞培 养箱中继续培养至80%-90%融合转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用PBS洗涤 两次后，加入PEI/DNA纳米粒混悬液以及DMEM培养基至终体积0.5mL,继续培养6小时；换用 完全培养基，继续培养至48小时每份样品平行操作三孔，并以脂质体Lipofectamine™2000做对 照（脂质体按说明书操作）转染后弃去细胞培养液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入200 pL细胞裂解液，充分裂解细胞, 10 min后收集细胞液然后离心（12,000 r/min, 5min） 取上清液用荧光分光光度计测定荧光强 度（Ex 488 nm; Em520 nm）,并将培养板直接置倒置荧光显微镜下于不同时间进行观察试验采用四II坐盐比色法（MTTAssay）⑶2X10、个/孔的细胞接种于24孔培养板，37C,CO2 孵箱培养24h,待细胞贴壁后，每孔中加入不同量PEI/DNA,每孔加入量根据细胞转染实验，即 当每孔中所含pEGFP为加g,且N/P不同比例时每孔所加的载体的量。

最终的工作体系为1000应 每一梯度做3个复孔，分别作用48h后，每孔加MTT溶液100nL（5mg/ml）,继续培养4 h,弃上清, 每孔加二甲基亚碉600 pL,酶联免疫测定570 nm处各孔吸光度（A）,以培养基为空白对照并与 脂质体Lipofectamine™2000相比较，取平均值，按（1）式计算细胞存活率：细胞存活率（％）= A 570（样M） / A 570（对照）X 100% （1）其中A 570（样品）为加入载体后的细胞的吸光度,A 570（对照）为空白对照的细胞的吸光度2结果2.1凝胶阻滞分析载体压缩DNA的能力采用凝胶阻滞分析见图1图1可看出当N/P大于0.5时，pEGFP被完全 阻滞在加样孔中，说明此时pEGFP巳完全和嫁接物结合而形成纳米颗粒眺DNA 0.5 2.5 5 7.5 10 15 20Fig. 1. Gel retarding analysis of PEI/pEGFP nanoparticles. Lane 1, naked pEGFP. Lanes 2 - 7, nanoparticles with N/P of 0.5, 2.5, 5.0, 7.5, 10, 15 and 20,respectively.2.2 PEI/DNA纳米粒粒径当N/P为10时，测得PEI/DNA纳米粒平均粒径为196.1nmo图2为PEI/DNA纳米粒粒 径分布图，粒径呈单峰，分布比较均一。

Fig. 2. The size distribution of PEI/pEGFP nanoparticles.23转染细胞的荧光表达量N/P比值对PE1介导基因转染影响非常显著（图3） 0结果显示，当N/P=10时PE1介导细 胞荧光强度最强，荧光蛋白最多，与使用Lipofectamine2000为载体的转染组相接近并经多 次传代、荧光显微镜观察，嫁接物对应的阳性细胞的表达可至少持续28天，这对提高生物利用 度非常有利L>=suol.5025007550250Fig. 3. Effect of N/P of transfection on fluorescence intensity.2.4荧光显微镜观察PEI和阳性对照脂质体介导的细胞转染的荧光显微镜观察见图4发现高表达和低表达pEGFP蛋白的绿色细胞，在视野中经常共同存在，说明同一时间细胞中参与表达的外源基因的 量是不同的PE1介导的细胞转染情况与脂质体相似，此结果与荧光表达揪吻合Fig. 4 Fluorescence images of gene expression for pet /dna。