重叠PCR问题概要.doc

关于重叠 PCR： 重叠 PCR 的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组 PCR 技术举个例子可能更容易说明比如两个基因，一个命名为 A，一个命名为 B A 的序列为 5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为 5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3我们的目的是将基因 A,B 通过 PCR 的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物 A2 和 B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在 A2 的 3 端加入了 20 个 B 基因 5端的序列，在 B1 的 5 端加入了 20 个 A 基因 3 端的序列。

我们来看重叠 PCR的步骤：（1）以 A1,A2 扩增 A 基因，B1 ，B2 扩增 B 基因（2）回收 A，B 基因（3）以 A，B 为共同的模板， A1 和 B2 为引物，扩增 A+B，这样我们就利用重组 PCR 的方法将 A+B 拼接起来了为什么会扩出 A＋B 呢？因为我们在设计引物的时候使 A，B 有了 20 个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出 A+B.第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板 A，B，dNTP ，Buffer，水，然后进行 3－5 个循环的扩增，然后在加入引物 A1 和 B2 以及 TAQ 酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp 等所有的反应成分均一起加入 PCR 管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦目前重叠 PCR 的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠 PCR 的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用 DNA 调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的 DNA 中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重叠 PCR 技术就可以轻松完成。

overlap 能成功，要点是 overlap 的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘 ”在一块）所以 overlap 的部分要有一定长度（一般有 25bp 的重叠区应该够长），并且注意这部分的 GC 含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的 Tm 值（例如 65 度），而且使用的 PCR 循环所用的退火温度应该低于此温度——否则 overlap 的部分可能 “粘”不到一起另外一点是要意识到 overlap 的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是 PCR 退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率前后两段越长越容易形成某种空间结构而这种空间结构可能会对 overlap 区的退火造成影响当然，overlap 区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑 overlap 区没有成功退火遇到这种情况建议使用 TouchDown PCR 试试TouchDown PCR 方法在分子克隆上有介绍这种 PCR 使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。

通常最高和最低退火温度间可相差十度Touch Down PCR 有利于解决空间结构影响overlap 区退火的问题，增加扩增成功的机会转载地址 2： 最近由于实验需要，做了两组 pcr，连接了一个启动子，一个调控子，还有一个抗性基因，三天就搞定三个 pcr 片段分别为 131bp, 650bp., 927bp如果你扩增的片段特异性好，用 PCR 回收试剂盒回收，方便快捷如果有杂带，只能切胶回收了下面从 pcr 引物设计，重叠 pcr 两个方面说一下1.重叠 pcr 引物设计很简单，就是和你平常的引物设计一样两个基因的引物都设计好了后，如：A 基因：5‘TTAAGACCCACTTTCACATT3’ 上游序列5‘ TAGATTAGATAAAAGTAAAGTG3’ 下游序列B 基因5‘ CATTAATTCCTAATTTTTGTTG3’ 上游序列5‘ GATTTTTGTCGAACTATTC3’ 下游序列把 A 基因的下游序列全加到 B 基因上游序列的 5'端把 B 基因的上游序列全加到 A 基因下游序列的 5‘端就万事 OK 了，别想着替你老板省钱，那是让你自己找罪受！2、重叠 pcr 的做法两个基因的 pcr 产物回收后20ul 体系，各取 1ul,其它的如加酶等一切照常， 但先不加两端引物。

94 度 2min94 度 30s50 度 1min72 度 1min 5 个循环72 度 10min加两端引物：A 基因的上游序列和 B 基因的下游序列94 度 2min94 度 30s58 度 1min72 度 1min 18 个循环72 度 10min延伸时间视你的基因长短来确定，一般普通 taq 酶 1kb 1min, 高保真酶 1min ,800bp。