鱼类DNA提取方法.doc

主要步骤如下：（1）取 50mg 左右的经无水乙醇浸泡过的肌肉样品，用灭菌的牙签挑成细丝状，自然晾干转入 1.5ml 离心管中，加入 500μl DNA 裂解液，加入 5ml 20mg/ml蛋白酶 K 振荡混匀55℃水浴保温 2～3 小时，每隔 10min 摇匀一次2）加入等体积的 Tris 饱和酚，摇匀,用封口膜封好， 37℃水浴 2～3 小时每隔 10min 摇匀一次3）10，000rpm 离心 10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1），摇匀 5～10min4）10，000rpm 离心 10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的氯仿，摇匀 5～10min5）10，000rpm 离心 10min，转移上清液至一新离心管中，加入 0.9 倍体积的异丙醇以及 0.1 体积的 3mol/LNaAc，摇匀 1～2min6）置于-20℃冰箱中 3 小时2.2 鱼类总 DNA 的纯化试剂：70％乙醇，无水乙醇，1XTE（Ph8.0）、1%琼脂糖1）将 2.2.1（6）的总 DNA 溶液，10，000rpm 离心 10min，去上清液，留下沉淀用 70％乙醇 500μl 洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。

重复此步骤一次2）10，000rpm 离心 10min，去上清液，留下沉淀，加入 500μl 无水乙醇洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击3）10，000rpm 离心 10min，去上清液，把离心管斜置于超净工作台中，自然晾干4）加入 50μl 1XTE 溶解 DNA 沉淀，用手指弹击，室温放置 30min，取 3μl DNA 用 1％琼脂糖进行电泳检测5）每个 DNA 样品分成两份，一份－20℃保存备用，另一份 4℃保存进行下一步实验1.3.1 DNA 的提取总DNA的提取采用改进的高盐法1、取鱼背部肌肉约0.01g，挥发乙醇后放入1.5mlBuffer管中用无菌小剪刀剪碎，加入400μL SDS提取缓冲液和8μL20mg/mL的蛋白酶K ，混均，放在55℃水浴锅中水浴2 h或者37℃过夜，中间震荡数次2、上清加入300μL的6M/L NaCl溶液，充分摇均， 10, 000g/min 离心30 min3、本文中加一步：上清移入新管加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，摇均，10, 000g/min 离心10min4、上清移入新管加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀1h以上，10, 000g/ min 离心10 min。

5、弃去上清液，沉淀用70%的酒精冲洗两次，无水乙醇洗一次6、室温下晾干，加入50μL TE 溶液溶解20℃保存，备用1.3.2 总 DNA 电泳检测取3μL DNA样品和1μL 溴汾蓝buffer混合，用1%的琼脂糖凝胶在75V电压下电泳30min，EB溶液染色15~20min，电泳结果用凝胶成像系统观察照相1.3.3 PCR 扩增体系与程序PCR反应在UNOⅡBiometra仪上进行，PCR 扩增引物序列为AFbL：5′-ACCG AGA CCAATGACTTGAARAACCACCGTTG-3′，AFbR：5′- CTTTGGGAGTTAGGGG TGGG AG-3′30 μL PCR反应体系包括：10× Taq Buffer 3.0 μLMgCl2 25 mM·L-1 3.0 μL dNTPS 2.5 mM·L-1 2.4 μLAFbL 20 mM·L-1 0.6 μmol/LAFbR 20 mM·L-1 0.6 μmol/LDMSO 1.5 μLBSA 0.1mg/ml 1.0μLTaq polymerase 0.9 UDNA模板 1 -2μL(约10ng)未足体积部分用无菌超纯水补足。

PCR反应程序为：95℃预变性3 min，然后95℃ 变性45s ，56℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共进行 32个循环，最后72℃延伸10 min反应设不含模板的反应液作空白对照，PCR 产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测得到清晰谱带，产物纯化后在ABI 3730自动测序仪上用扩增引物双向测序。