共聚焦显微镜.pdf

技术原理技术原理 应用 激光共聚焦显微技术激光共聚焦显微技术 深圳大学 医学院深圳大学 医学院 生物医学工程生物医学工程 姓名：傅莉姓名：傅莉 普通镜： 对较厚的标本（如细胞）进行观察时，来自 观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形 成较大的干扰 普通镜 共聚 焦镜 共聚焦镜： 只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通 过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二 维或者三维图象 优点：来自焦点以外的光信号不会对图像形成 干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细 节分辨能力 •美国科学家马文•闵斯基(Marvin Minsky)发明的 •1957年就申请了专利 •直到八十年代后期，激光研究的长足进步，才 使得激光共聚焦扫描显微技术（CLSM）成为 了一种成熟的技术 •共聚焦显微镜实物图 原理图原理图 原理图 激发荧光的激光束(Laser)——入射小孔(light source pinhole)——二向色镜 (Dichroic mirror)反射——显微物镜(Objective lens)汇聚——标本(specimen)内部 焦点(focal point) 激光照射所产生的荧光(fluorescence light)+反射激光——被物镜重新收集— —二向色镜。

其中携带图像信息的荧光波长较长，直接通过二向色镜并 透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)——变成电信号— —送入计算机 出射小孔 出射小孔（Detection pinhole）：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出 射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝 大部分无法通过中心的小孔因此，焦平面上的观察目标点呈现亮 色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰 在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一 一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技 术 优点 1、成像清晰、成像清晰 利用光学或数字技术消除了聚焦平面以外的荧光信号的干 扰, 使我们要分析的区域内的图像清晰度提高, 得到更为准确 的定位和定量信息 2、连续片层扫描及图像重组、连续片层扫描及图像重组 对样品中的不同层面进行连续逐层扫描, 以获得各个层面 的图像 3、活体观察、活体观察 显示在活体情况下细胞内的真实结构和生理学特征 4、获得数量化信息、获得数量化信息 获得二维或三维空间内分布在样品不同部位的荧光强度 数值以及荧光强度在各种处理条件下的变化情况。

量化信息的获得是研究活细胞内生理生化反应时重要的 手段 5、多标记技术、多标记技术 利用共聚焦系统可以同时对利用两种或三种不同的荧光 染料分别标记了细胞的不同结构(如分别标记染色体和细 胞骨架系统) 的样品进行观察, 优点 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图 像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光共聚焦 显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内 焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针 孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT)，迅速在 计算机监视器屏幕上形成荧光图像 Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing) Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing) 共聚焦显微的相关技术共聚焦显微的相关技术 染色剂的选择 可以用于对细胞膜、各种细胞器、细胞核、细胞骨架、细 胞内游离离子(Ca2+ 、M g2+ 等)和多糖等物质的染色 生物体内除了少数物质可以受激产生自发荧光之外, 大多 数分子本身没有荧光, 必须借助于染色技术。

孵育法 损伤 导入法 转基因法 •对免疫荧光标记(单标、双标或三标)的样品进 行定位定量分析 ＊进行细胞膜受体分析、某种蛋白或酶的分布与表达 ＊微丝、微管的分布 ＊两种或三种蛋白的共存与共定位 ＊蛋白与亚细胞器的共定位 ＊核转录因子转位，细胞的增值、分化 ＊细胞凋亡的检测(利用AnnexinV-fitc + PI、末端原位杂交-fit+ PI、 8-氧脱氧鸟苷)与荧光原位杂交的染色体基因定位技术 共聚焦显微的应用共聚焦显微的应用 应用 •CT与三维重组与三维重组 通过共聚焦技术对样品进行xyz轴的三维切割并重组， 其中光切层数要满足VoxelsizeZ ≥ 2VoxelsizeX(Y)的关系 共聚焦显微的应用共聚焦显微的应用 应用 •荧光漂白恢复－FRAP 具备荧光漂白恢复测量的功能 荧光漂白恢复： 某一区域荧光分子一旦被强光（即激光）照射后，荧光 分子的化学结构被破坏，不再发荧光，即发生光漂白光漂白 被照射区域随着周围荧光分子不断运动到此处而荧光逐 渐恢复 逐 渐恢复 因此，荧光漂白恢复的多少（荧光漂白恢复率）及荧光 漂白恢复的快慢（荧光漂白恢复速率）可以代表分子的 运动速度 共聚焦显微的应用 应用 共聚焦显微技术共聚焦显微技术 谢谢！ 。