马氏珠母贝STARDL3基因的克隆与表达性分析.doc

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达 性分析雷超郑哲王庆恒黄荣莲邓岳文杜晓东广东海洋大学水产学院广东省珍珠养殖与加工工程 技术研究中心采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3); 利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量结果表明，Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编 码 496 个氨基酸，5’非翻译区(5’UTR)长 110 bp, 3’UTR 长 2 054 bpPmSTARDL3 氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类捞孔扇贝(Mimachlamys nobilis) STARDL3的序列的相似度最高SMART软件分析得出，Pm_STARDL3有STARD类蛋 白特有的结构域荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最 高，其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌，各组织的表达量差异具统计学意义 (p<0. 05)关键词：马氏珠母贝;STARDL3;基因兗隆;基因表达;邓岳文，dengyw@gdou. 基金：国家自然基金“马氏珠母贝生长性状QTLs精细定位与相关基因功能分析 (31372526) ”Clone and Expression Analysis of STARDL3 Gene from Pinctada fucata martensiiLei Chao Zheng Zhe Wang Qingheng Huang Ronglian Deng Yuewen Du XiaodongFisheries College, Guangdong Ocean University;Abstract：Tn this study, the full length of Pm-STARDL3 was obtained by using RACE technology. The expression of tissue-specific was detected by Real-time 1)CR. The results showed that the total length of l)m-STARDL3 gene was 3 655 bp, including 1 491 bp of the open reading frame (ORF) that encoded 496 amino acids, a 5’UTR of 110 bp and a 3’ UTR of 2 054 bp. Multiple sequence alignment indicated that Pm-STARDL3 was high identity with Mimachlamys nobilis. Protein sequence analysis showed that Pm-STARDL3 has a typical START structural domain.Fluorescence quantitative PCR analysis showed that the hepatopancreas had the highest expression of Pm_STARDL3 gene, followed by mantle, gill and adductor muscle, and the expression difference of the organization had statistical significance.Keyword：Pinctada fucata martensii; STARTDL3; Gene cloning; Gene expression;st AR 相关脂质转运蛋白-3 类似蛋白(st AR-related lipid transfer protein 3-like protein, STARDL3)属于类固醇急性调节蛋白(steroidogenacute regulatory St AR)家族。

它与 STARD3 (st AR-related lipid transferprotein 3)有很高的同源性，都有START结构域，此结构域是STARD类蛋Q的特有结构 域(邢晋祎等，2015),能结合多个疏水配体并经常出现在多结构域蛋白中，起 到调节其它功能结构域的作用(Roderick et al., 2002),因而参与众多的生 理过程目前己知STARD3参与肭固醇、类固醇和脂类的物质的合成以及代谢过 程(裘越，2013)例如，人类视网膜STARD3是类胡萝卜素结合蛋闩，其作用 是特异性结合叶黄素(Horvath et al., 2016)，其功能位点是在C-端第 216〜444位氨基酸上的START结构域STARDL3作为St AR家族的成员之一，与 STARD3有和同的功能结构域，也参与脂类物质的代谢(Wilhelm et al., 2016), 0前还未见有W类STARDL3基因功能的研宄报道马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)又称合浦珠母贝(Panctudu fucutu) 是我国南方重要的海水育珠贝，主要生产有核珍珠，具有重要的经济价值珍珠 颜色与色度均一性是衡量珍珠价值的重要指标(张根芳等，2014)。

近年来，我 W海水珍珠生产色译度好的优质珍珠比例较低(韩继卫等，2011)如何提高珍 珠的色泽度成为大家关注的问题现有研究表明，脂溶性的类胡萝卜素是珍珠层 致色的重要原因之一(张刚生，2001)韩继卫等(2011)发现当三角帆蚌的生 长水域中添加浓度为0.000625%的P-胡萝卜素时，能够影响Ca C03文石规则地 结晶，明显地提高三角帆蚌早期珍珠的色泽度鉴于STARDL3能参与脂类物质 (类胡萝卜素)的吸收与代谢，本实验通过克隆技术获得马氏珠母贝 Pm-STARDL3的全长，并进行了表达分析，为探索其在马氐珠母W类胡萝卜素代 谢提供基础，从而为培育优质海水珍珠奠定基础1结果与分析1.1 Pm-STARDL3基因的克隆与序列分析利用本实验室的马氏珠母贝转录组数据库，并使用Primer 5软件设计基因特异 性引物然后通过RACE技术获得马氏珠母贝Pm-STARDL3的3’端序列和5’端序 列，其中3’端序列长2 054bp, 5’端序列长llObp经拼接后，获得了 Pm-STARDL3 的全长3655 bp,开放阅读框(ORF)长1491bp，编码496个氨基酸(图1)1.2 Pm-STARDL3蛋白质理化性质分析利用软件Ex PASy分析Pm-STARDL3蛋白相关性质，其分子量为56. 74 k D, 理论等电点为5. 12，脂溶性系数(aliphatic index) 84.29,不稳定指数41. 48, 属于不稳定蛋白，总〒均亲水性(grand average of hydropathicity)为 -0.229,属于疏水性蛋白。

通过Signal4. 1预测，Pm_STARDL3不含信号肽，属 于非分泌蛋白用Motif Scan对Pm_STARDL3序列进行功能位点检测，从结果可 知，该蛋白有1个N-糖基化位点，1个c AMP和c GMP依赖性的蛋白激酶磷酸化 位点，13个酪蛋白激酶II磷酸化位点，7个N-豆蔻酰化位点，6个蛋A激酶c 磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点(阁2)1.3 Pm-STARDL3与其它物种的同源性分析比对利用Clustal W2软件，将华贵类椅孔扇災(Mimachlamys nobilis,XP_JM13632. 1)、堡礁海绵(Amphimedon queenslandica, XP_003386712. 1)、 端足虫(Ilyalcllaaztcca, XP_018028136. 1)、裳(Limulus polyphemus,XP_013773968. 1)的START序列与Pm_STARDL3序列进行同源比对(图5)利用 DNAMAN,对叶吻银鲛(Callorhinchus milii, XP_AFP01041. 1)、响尾蛇 (Crotalus adamanteus, XP_AF J51528. 1)、珊瑚蛇(Micrurus fulvius, XP_JAT09366. 1)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi,XP_006798335. 1) > 温室希蛛(Parasteatoda tepidariorum,XP 015928314. 1)、囊舌虫(Saccoglossus kowalcvskii, XP 006819426. 1)、 堡礁海绵(Amphimedonqueenslandica, XP 003386712. 1),端足虫(Hyalella azteca, XP_018028136.1)，鲎(Limulus lyphepomus, XP_013773968.1)、华 贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis, XP_JM13632. 1) STARDL3 序列建立系统 进化树的构建。

其中马氏珠母贝与华贵类栉孔扇贝聚类在同一亚支上，说明这2 个氨基酸序列具有较高的同源性(阁6)采用SWISS-MODEL对马氏珠母贝的STARDL3蛋白进行三维结构预测，发现其与平 贵类栉孔扇災的三维结构极为相似这种空间三维结构的高度保守性暗示该蛋白 分子的结构与其功能之间可能存在着相关性(图7)(王志新等，2013)1.4 Pm-STARDL3基因组织表达差异分析通过荧光定量PCR检测马氏珠母贝鳃、外套膜、闭壳肌、肝胰脏4个组织 Pm-STARDL3的差异情况结果得出，Pm_STARDL3在4个组织中均有表达，在肝 胰脏的表达量显著高于其它组织(p〈0.05)(图8)2讨论本实验利用RACE技术克隆获得了 Pm-STAKDL3基因的全长序列该基因全长3 655 bp,共编码496个氨基酸经NCBI中的blast比对可知，Pm-STARDL3属于类固 醇急性调节蛋白(steroidogenacute regulatory, St AR)家族并含有2个不同 结构域:N末端包含一个MENTAL结构域，该结构域冇3个潜在跨膜域，具冇捕获 固醇类物质的功能(Vassilcv ct al., 2015) ;C末端有与类固醇急性调节蛋白 (St AR)相关的脂类转运(START)结构域(Alpy et al., 2003),参与脂类转 运或代谢(邢晋祌;等，2015)。

类固醇合成快速调节蛋白(St AR)和关的脂类 转移结构域(START)在植物和动物中的进化过程都非常保守(黄茂华，2012)， 被定义为一个大约200个氨基酸序列，与脂类和多醇类物质结合相关(由诗东， 2014)利用SMART软件对其进行蛋Q结构分析发现，Pm-STARDL3的类固醇急 性调节蛋白(St AR)相关的脂类转运(START)结构域位于第294个到第495 个氨基酸，占据202个氨基酸位这符合START结构域进化过程保守这一特点 有研宄指出，在动物体内，START结构域可以参与脂类物质的代谢(Tabunoki et al., 2002)，如含有START结构域的蛋白STARD4、STARD5等参与体内固醇 类的运输(Alpy ct al., 2003),蚕体内的类胡萝卜素结合蛋白(CBP)特异性 结合类胡萝卜素(牛艳山，2010)推测Pm-STARDL3可能参与马氏珠母贝体内 脂类物质转运或代谢图1 Pm-STARDL3基因的c DNA序列及编码的氨基酸序列Figure 1 The full length c DNA and。