微生物平板划线试验法.ppt

平板划线实验实习 一、相关基础理论－－细菌的培养o一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖 ，以便进一步观察和研究他们的各种生物学特征 为了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时， 除采用适宜的培养基，并考虑到其他的培养条件之 外，掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重 要环节 1、培养基 o在土壤、水、食品、空气以及人和动、植物中，不 同种类的细菌混杂地生活在一起若要研究其中某 种细菌，就必须将各种细菌进行分离，以得到只含 有这一种细菌的纯培养当细菌分离成纯种后，常 需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学 性状，不同的细菌需要不同的培养基进行培养 1、培养基o培养基按其物理性状，分为固体培养基、液体培养 基和半固体培养基o培养基按用途，分基础培养基、加富培养基、选择 培养基、鉴别培养基按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固 剂，使其成为固体状态，琼脂含 量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分 离、鉴定、活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征、分类鉴 定及噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行 微生物的基础理论和应用方面的 研究 按用途不同划分基础培养基鉴别培养基用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基微生物产生某种代谢产物，与培养 基中的特殊化学物质发生特定的化 学反应，产生明显的特征变化牛膏蛋白胨培养基是最常用 的基础培养基加富培养基2、常见培养基基础培养基 肉浸液培养基：一般细菌都能在此培养基内生长 营养琼脂培养基：一般细菌培养使用 蛋白胨水培养基：靛基质实验2、常见培养基加富培养基 血琼脂培养基：可作为肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、嗜血杆菌等的分离培养，还可用于某些菌落的溶血作用 巧克力琼脂培养基：淋球菌及脑膜炎双球菌在此培养基上生长较佳2、常见培养基选择培养基 亚硒酸盐增菌液：作为沙门氏菌属及某些志贺氏菌属增菌用 伊红－美蓝琼脂：分离沙门氏及志贺氏菌属细菌 Baird-Parker培养基：用于金黄色葡萄球菌的培养分离2、常见培养基鉴别培养基 三糖铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 双糖含铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 葡萄糖枸橼酸盐琼脂：共作鉴别大肠杆菌与产气杆菌之用二、细菌的接种方法o将混合的细菌分离的方法有多种，平板划线法即是 其中之一，该方法主要是借划线而将混杂的细菌在 琼脂平板表面分散开，是单个细菌能固定在某一点 ，生长繁殖后形成单个的菌落以达到分离纯种的目 的。

o当细菌分离成纯种后，一般还可用斜面、液体和半 固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法 可相应的分为四种 表3 常见的几种细菌的培养和基接种方法举例 平板划线接种 法斜面培养基 接种法液体培养基 接种法穿刺接种法菌种 葡萄球菌和大 肠杆菌的混合 菌液大肠杆菌培养 物大肠杆菌培养 物枯草杆菌培养 物变形杆菌培养物 痢疾杆菌培养物培养基 普通琼脂平板琼脂斜面 培养基普通肉汤 培养基半固体琼脂 培养基1、斜面培养基接种法 o常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些 生化特性琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基 、柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基均 可用此法接种 1、斜面培养基接种法步骤：（1）用记号笔在待接种的培养管上写明标记2）点燃酒精灯3）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管，使菌种管位于左侧，斜面部均应向上4）以右手拇指和食指捏持转动两管试管塞，以便在接种是易于拔取5）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌1、斜面培养基接种法（6）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并夹持两管试管塞，将两管管管口灭菌 （7）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管。

再伸进待接种的培养基管，进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面1、斜面培养基接种法（8）接种完毕，灭菌两试管的管口，塞好试管塞，并 放至原来的位置上重新烧灼接种环，灭菌后放回 试管架上接种好的试管放37℃温箱培养，18～ 24小时候观察生长情况1、斜面培养基接种法o图2-1 斜面培养基接种法2、液体培养基接种方法o可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊 ，有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜； 另外还可以供测定细菌生化特性用凡是肉汤、葡 萄糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均 用此法接种 2、液体培养基接种方法步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及接种的肉汤管3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨，蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中塞好试管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上肉汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长情况 2、液体培养基接种方法o图2-2 液体培养基接种法 3、穿刺接种法o常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁 培养基等的接种，前者用于测定细菌的动力，后二 者则用于观察细菌的生化反应。

3、穿刺接种法步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记2）如斜面培养基接种法，握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基3）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，刺达近管底部，但不必及于管底，然后循原路退出4）接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架上，塞好试管塞，37℃培养18～24小时后取出观察细菌的生长情况3、穿刺接种法o图2-3 穿刺接种法 4、平板划线接种法 o常用于分离单个菌落，也可用于观察细菌的生长状 况和观察某些生化反应沙门氏菌的各属在亚硫酸 铋琼脂平板上呈黑色，具有金属光泽；志贺氏菌属 在HE琼脂平板、SS琼脂平板、麦康凯琼脂平板上 呈现无色透明不发酵乳糖的菌落 4、平板划线接种法——接种方法（1）标记 在培养皿底面，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、日期等 4、平板划线接种法 （2）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，并放置火 焰中烧灼灭菌，先将接种环的接种丝部分置于火焰 中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接烧灼金 属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通 过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2~3次然 后将接种环移开火焰，待其冷却。

4、平板划线接种法 o图2-4 灭菌接种环4、平板划线接种法 （3）取菌种左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液的 试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞 ，将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取 一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口 再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来 的位置 4、平板划线接种法 （4）分离划线接种细菌（四区接种法）①左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒 精灯附近），尽量使之直立以免空气中的细菌落入 其中，并靠近火焰右手持接种环在琼脂平板上端 来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板的1/10）， 视为一区划线时使接种环与接种平板面呈30~40 度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作 ②旋转琼脂平板90度，烧灼接种环，以杀灭环上 的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却 灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平 板1/5），此视为二区4、平板划线接种法 ③旋转琼脂平板90度，灼烧接种环灭菌并使之冷 却将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板 1/4），此为三区④旋转琼脂平板90度，接种环不必再灭菌，接三 区连续平行划线，划满平板其余部分，此视为四区 。

各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀 释的目的 4、平板划线接种法 o图2-5 四区划线4、平板划线接种法4、平板划线接种法 （5）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放 ，送进37℃温箱培养6）培养18~24h后将培养皿取出观察琼脂平板表 面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表 面结构、透明度、颜色等性状 三、金黄色葡萄球菌和普通大肠杆菌 平板划线接种实验o1、实验内容o2、实验目的o3、实验用品o4、实验步骤o5、观察结果1、实验内容（1）四区划线法接种金黄色葡萄球菌至血琼脂培 养基平皿一个（2）四区划线法接种普通大肠杆菌至伊红美蓝培 养基平皿一个2、实验目的（1）熟悉四区划线法接种细菌（2）培养严格的无菌操作意识3、实验用品（1）菌液：金黄色葡萄球菌和普通大肠杆菌 菌液各一管2）实验器械：酒精灯一个、血平板一个、 伊红美蓝平板一个、接种环一支4、实验步骤o参照前面介绍的四区划线法的操作步骤操作 ，一定要在无菌条件下，养成无菌意识1）标记（2）灭菌接种环（3）取菌种（4）分离划线接种细菌 （5）划线完毕，送进37℃温箱培养（6）培养18~24h ，观察结果5、观察结果结果观察在18~24小时以后菌落：标本或液体培养物划线接种到固体培养基表 面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。

5、观察结果(1)菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜 花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑 、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色 、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙 等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等 5、观察结果(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况①α溶 血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm 的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②β溶血：又称 完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环 ，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；③γ 溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细 胞没有溶解或缺损 5、观察结果(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围 的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等 颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特 殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（ 巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、 白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等 圆形、突起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽 ，不透明菌落，直径1～2mm。