微波辅助萃取-气相色谱-质谱联用分析石蒜中的加兰.ppt

微波辅助萃取微波辅助萃取—气相色谱气相色谱—质谱联用质谱联用            分析石蒜中的加兰他敏分析石蒜中的加兰他敏 指导老师：指导老师： 李攻科教授李攻科教授报告人：报告人：     汪军霞汪军霞1.  前言前言                                      u前苏联科学家首次分离出了加兰他敏前苏联科学家首次分离出了加兰他敏u加兰他敏是一种具有可逆性和选择性的加兰他敏是一种具有可逆性和选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChE），），可以可以作为治疗作为治疗AD的药物  1.1  加兰他敏及其氢溴酸盐的化学性质和组成加兰他敏及其氢溴酸盐的化学性质和组成分子式分子式 ：：C17H21NO3 分子量分子量 ：：287.36化学名称化学名称 ：：4a,5,9,10,11,12-Hexahydro-3-methoxy-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-6-ol                           1.2  分析研究现状分析研究现状u药理作用研究概况药理作用研究概况u加兰他敏的传统提取方法加兰他敏的传统提取方法u加兰他敏的分析检测方法加兰他敏的分析检测方法1.2.1  药理作用研究概况药理作用研究概况u重症肌无力重症肌无力u脊髓前角灰质炎（小儿麻痹症）后遗症脊髓前角灰质炎（小儿麻痹症）后遗症u术后肠肌麻痹术后肠肌麻痹u尿潴留尿潴留 u解箭毒解箭毒u阿尔茨海默病阿尔茨海默病1.2.1.1  药理作用特点药理作用特点u具具有有可可逆逆性性和和选选择择性性的的乙乙酰酰胆胆碱碱酯酯酶酶抑抑制剂（制剂（AChE））u作用时间长作用时间长u无毒性或致癌作用无毒性或致癌作用u 耐受性好耐受性好  1.2.2  加兰他敏的传统提取方法概述加兰他敏的传统提取方法概述u传统生产工艺：将石蒜通过乙醇热提，洗传统生产工艺：将石蒜通过乙醇热提，洗涤，萃取，重结晶，得到氢溴酸加兰他敏涤，萃取，重结晶，得到氢溴酸加兰他敏原料药。

原料药u缺点：能耗高、原辅料损耗大、生产周期缺点：能耗高、原辅料损耗大、生产周期    长，而且加兰他敏提取不完全长，而且加兰他敏提取不完全 1.2.3  加兰他敏的分析检测方法综述加兰他敏的分析检测方法综述u薄层色谱（薄层色谱（TLC））u高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）） u气相色谱法（气相色谱法（GC）） u免疫分析法（免疫分析法（IA）） u高效毛细管电泳高效毛细管电泳（（HPCE））u联用方法联用方法1.3  微波辅助萃取技术微波辅助萃取技术u微波辅助萃取原理微波辅助萃取原理u微波辅助萃取特点微波辅助萃取特点u微波辅助萃取系统微波辅助萃取系统uMAE在植物提取中的应用在植物提取中的应用1.3.1  微波辅助萃取原理微波辅助萃取原理  u微波加热有两种机理：离子传导和偶极微波加热有两种机理：离子传导和偶极子转动u物质吸收微波的程度主要取决于其介电物质吸收微波的程度主要取决于其介电常数，被萃取物质进入介电常数小，微常数，被萃取物质进入介电常数小，微波吸收能力相对较差的萃取剂中波吸收能力相对较差的萃取剂中  1.3.2  微波辅助萃取特点微波辅助萃取特点u升温速度快升温速度快u加热均匀加热均匀u选择性好选择性好u萃取效率高萃取效率高u伴有生物效应伴有生物效应 1.3.3  微波辅助萃取系统微波辅助萃取系统   高压密闭微波萃取系统高压密闭微波萃取系统 ：：u    磁控管磁控管u    波导管波导管u    微波腔微波腔u    波形搅拌器波形搅拌器u    循环装置循环装置u    转台转台       1.3.4  MAE在植物提取中的应用在植物提取中的应用 u最早的报道来自最早的报道来自1986年，匈牙利学者年，匈牙利学者Ganzler K用微波提取了羽扇豆、玉米等作物中的油脂、用微波提取了羽扇豆、玉米等作物中的油脂、棉籽酚等有效成分棉籽酚等有效成分 。

u国内外已有很多将国内外已有很多将MAE应用于中药中有效成应用于中药中有效成分提取的文献报道分提取的文献报道u本实验室的研究人员在这方面也做了大量的工本实验室的研究人员在这方面也做了大量的工作 2   实验部分实验部分u仪器及操作条件仪器及操作条件u试剂和样品试剂和样品u样品处理过程样品处理过程u定性和定量定性和定量2.1  仪器及操作条件仪器及操作条件 仪器仪器uMarsⅩ型微波炉型微波炉（（CEM，，USA）；）；uR201旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；uHP-6890GC-5973MSD配配 G1701B.02.05工工 作作 站站（（Hewlett-Packard，，USA））;uDB-5MS熔融毛细管柱（熔融毛细管柱（J&W，，CA）操作条件操作条件u色色谱谱条条件件：：升升温温程程序序初初温温150 ℃，，保保持持3 min，，以以6 ℃ / min的的速速度度升升至至300 ℃，，保保持持5 min进进样样口口温温度度250 ℃，，不不分分流流进进样样载载气气为为高高纯纯氦氦气气，，流流速速1.0 mL / minu质谱条件：接口温度质谱条件：接口温度280 ℃，，EI，，电子电子能量能量70 eV，，离子源温度离子源温度230 ℃，四极杆，四极杆温度温度150 ℃，质量扫描范围，质量扫描范围50 ～～ 550 amu。

 2.2 试剂和样品试剂和样品u氢溴酸加兰他敏标准品购自氢溴酸加兰他敏标准品购自Sigma公司u甲甲醇醇、、乙乙醇醇、、石石油油醚醚（（沸沸程程：：90～～120 ℃））、、乙乙醚醚、、丙丙酮酮、、乙乙酸酸乙乙酯酯、、盐盐酸酸、、浓浓氨氨水水、、碳碳酸酸钠钠（（分分析析纯纯试试剂剂，，广广州州化化学试剂厂）学试剂厂）u石蒜：鳞茎棕黑色片状物，有特殊香味石蒜：鳞茎棕黑色片状物，有特殊香味2.3  样品处理过程样品处理过程u前处理：前处理： 粉碎，过筛，储存在干燥器中粉碎，过筛，储存在干燥器中u微微波波辅辅助助萃萃取取：：定定量量称称取取样样品品放放入入微微波波罐罐中中，，加加入入一一定定体体积积的的萃萃取取溶溶剂剂，，在在一一定定的的控控制制温温度度下下萃萃取取一一定定的的时时间间取取出出萃萃取取液液，，过过滤滤，，滤滤液液旋旋干干后后甲甲醇醇溶溶解解，，定容至定容至5 mLu乙乙醇醇加加热热回回流流萃萃取取：：准准确确称称取取1 1 g g石石蒜蒜样样品品，，放放入入圆圆底底烧烧瓶瓶中中，，加加入入一一定定体体积积的的萃萃取取溶溶剂剂，，水水浴浴加加热热回回流流2 2 h h后后，，冷冷却却过过滤滤，，再再旋旋转转蒸蒸发发至至近近干干，，用用甲甲醇醇定定容容至至5 5 mLmL，，取取1 1 μLμL用用GC-MSGC-MS测定。

测定2.4  定性和定量定性和定量      采采用用未未经经衍衍生生化化的的GC-MS方方法法进进行行定定性性，，以以峰峰面面积积定定量，不分流进样，进样量量，不分流进样，进样量1 μL     图一图一  加兰他敏甲醇标准溶液色谱图加兰他敏甲醇标准溶液色谱图           图二图二  石蒜样品的甲醇溶液色谱图（标记为石蒜样品的甲醇溶液色谱图（标记为1的是加兰他敏的是加兰他敏的峰）的峰）3  结果与讨论结果与讨论u微波萃取溶剂的选择微波萃取溶剂的选择u微波条件的优化微波条件的优化u微波辅助萃取方法的线性范围、检出限、微波辅助萃取方法的线性范围、检出限、回收率和精密度回收率和精密度u和传统方法的对比和传统方法的对比3.1  微波萃取溶剂的选择微波萃取溶剂的选择u正确选择萃取溶剂是实现高效率萃取的关键正确选择萃取溶剂是实现高效率萃取的关键     步骤uMAE中，所选的溶剂应满足以下条件：中，所选的溶剂应满足以下条件：     1 具有吸收微波及将微波转化为热能的具有吸收微波及将微波转化为热能的                能力；能力；     2 能够选择性的从样品基体中将待测物分离萃能够选择性的从样品基体中将待测物分离萃        取出来；取出来；     3 方便于后续处理过程方便于后续处理过程。

                                                              表表1  不同溶剂萃取效率的比较不同溶剂萃取效率的比较      溶剂溶剂  甲醇甲醇    乙醇乙醇丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯加兰他敏加兰他敏的含量的含量0.0232％％0.0064％％   －－       －－   3.2微波条件的优化微波条件的优化 实验号实验号颗颗 粒粒 度度/mesh溶溶剂剂体体积积/ml辐辐射射温温度度/ C 辐辐射射时时间间             /min  峰面积峰面积相对峰面积相对峰面积      1  20~40      10      65      511906302      36.8      2  20~40      20      75      1521394576      66.1      3  20~40      30      85      2527012145      83.5      4  40~60      10      75      2522631878      69.9      5  40~60      20      85      532366940      100      6  40~60      30      65      1531475106      97.2      7   >60      10      85      1518904841      58.4      8   >60      20      65      2521981459      67.9      9   >60      30      75      525350629      78.3表表2  微波萃取条件的正交实验设计及峰面积结果（微波萃取条件的正交实验设计及峰面积结果（OAD9(43)））  表表3  各因素不同水平对应的峰面积之和及平均值（各因素不同水平对应的峰面积之和及平均值（% ））注：注：Ki—峰面积之和；峰面积之和；ki—峰面积平均值。

峰面积平均值    颗粒度颗粒度  ／／mesh   溶剂体积溶剂体积   ／／mL   辐射温度辐射温度    ／／℃  辐射时间辐射时间／／minK1  60313023  53443021  65362867  69623871K2  86473924  75742975  69377083  71774523K3  66236929  83837880  78283926  71625482k1  20104341  17814340  21787622  23207957k2  28824641  25247658  23125694  23924841k3  22078976  27945960  26094642  23875161 图三图三      颗粒度、溶剂体积、控制温度、辐射时间于萃取效率的影响颗粒度、溶剂体积、控制温度、辐射时间于萃取效率的影响              表表4    优化的微波萃取条件优化的微波萃取条件 颗粒度颗粒度／／mesh溶剂体积溶剂体积 ／／mL辐射温度辐射温度  ／／℃辐射时间辐射时间 ／／min  40~60     20     8553.3 微波辅助萃取方法的线性范围、微波辅助萃取方法的线性范围、检出限、回收率和精密度检出限、回收率和精密度  表表5   线性范围、检出限、回收率和精密度线性范围、检出限、回收率和精密度线性方程线性方程Y=3.3048E5X－－1.2784E7线性相关系数线性相关系数R0.9996线性范围线性范围10 ~ 100 mg·L-1检出限检出限3.42 mg·L-1回收率回收率99.3 %RSD7.9 %(n=6)3.4 和传统方法的对比和传统方法的对比  表表6  微波萃取法与乙醇加热回流萃取法测定微波萃取法与乙醇加热回流萃取法测定加兰他敏的结果比较加兰他敏的结果比较 加兰他敏的含量加兰他敏的含量/ mg·L-1  RSD/%(n=6)萃取时间萃取时间/min微波萃取法微波萃取法 96.64.45 乙醇加热回乙醇加热回流萃取法流萃取法99.4 9.91204. 结论结论                  本实验建立了本实验建立了MAEMAE－－GCGC－－MSMS分析石蒜中加兰分析石蒜中加兰他敏的方法，并且利用正交设计实验优化了微他敏的方法，并且利用正交设计实验优化了微波萃取测定石蒜样品中加兰他敏的条件波萃取测定石蒜样品中加兰他敏的条件, ,方法方法平均回收率平均回收率99.3 %99.3 %，检出限，检出限3.42 3.42 mgmg·L L-1-1，，RSD = 4.4 %RSD = 4.4 %，，线性范围线性范围10 10 ~ 100 100 mgmg·L L-1-1。

将本方法与乙醇加热回流提取法相比，结果表将本方法与乙醇加热回流提取法相比，结果表明本方法省时、精密度好、操作简便，适合于明本方法省时、精密度好、操作简便，适合于石蒜中加兰他敏的快速测定石蒜中加兰他敏的快速测定                     致致   谢 u在在本本论论文文的的研研究究工工作作和和写写作作过过程程中中，，得得到到了了许许多多人人的的指导、关心和帮助指导、关心和帮助u首首先先，，要要衷衷心心感感谢谢我我的的导导师师李李攻攻科科教教授授，，感感谢谢她她对对我我认真严谨的悉心指导和无微不至的关怀认真严谨的悉心指导和无微不至的关怀 u在在整整个个论论文文设设计计和和操操作作过过程程中中，，栾栾伟伟师师兄兄给给予予极极大大的的支支持持和和帮帮助助，，从从他他身身上上我我学学到到了了大大量量的的知知识识和和科科学学的的研研究究方方法法 ；；实实验验室室的的许许多多老老师师和和同同学学也也给给予予了了我我大大量量帮助和有益指点帮助和有益指点 u特特此此鸣鸣谢谢中中山山大大学学化化学学与与化化学学工工程程学学院院综综合合化化学学实实验验创新研究基金的资助创新研究基金的资助 ！！                      谢谢      谢谢。