CXCL12CXCR4CXCR7在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达及临床意义.pdf

分类号：R 7 3 7 ．1 4密级：学位类别：科学学位团专业学位口 学校代码：10062学号：2 0 1 0 6 0 2 4 4 1 学科门类：医学 又坪眚科鼻号硕士学位论文M L A S T E R ’SD I S S E R T A T I o N论文题目：C X C L l 2 ．C X C R 4 ／C X C R 7 在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达及临床意义TIT LEE x p r e s s i o na n dC l i n i c a lS i g n i f i c a n c eo fC X C L l 2 ．C X C R 4 ／C X C R 7i nB l a d d e rU r o t h e l i a lC a r c i n o m a一级学科：临床医学二级学科：外科学泌尿外论文作者：张振丰·指导教师：孙光导师组成员：郭战军王一天津医科大学研究生院二一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

学位论文作者签名：’』嶝日期：沙诲朗≯日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库保密口，在——年解密后适用本授权书本论文属于不保密囹． 请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：期：砂．≥年} 廖日期：工D 哆年罗月弓u 日天津医科人学硕士学位论文中文摘要目的：观察趋化因子C X C L l 2 及其受体C X C R 4 、C X C R 7 在膀胱尿路上皮细胞癌和正常膀胱粘膜组织中的表达情况，分析三种蛋白在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达与临床病理因素( 年龄、性别、吸烟史、初复发、临床分期、病理分级) 之间的关系；探讨C X C L l 2 、C X C R 4 、C X C R 7 三者之间的相关性，从而为进一步研究C X C L l 2 ．C X C R 4 ／C X C R 7 生物学轴在膀胱尿路上皮细胞癌发生、发展中的作用及其可能的分子机制提供线索方法：采用免疫组织化学实验技术( I m m u n o h i s t o c h 廿n i s t r y ，I H C ) 检测9 5例膀胱尿路上皮细胞癌和1 7 例正常膀胱粘膜组织中C X C L l 2 、C X C R 4 、C X C R 7的表达情况，应用统计学分析三者在膀胱尿路上皮细胞癌和正常膀胱粘膜组织中的表达情况，确定是否存在统计学差异；进一步分析三种蛋白在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤初复发、临床分期、病理分级等临床病理因素之间的关系，以及C X C L l 2 、C X C R 4 、C X C R 7 三者在膀胱尿路上皮细胞癌中表达的相关性。

数据分析采用S P S S l 7 ．0 统计学软件进行，不同组别之间差异的比较采用方差分析，各指标之间的相关性采用P e a r s o n 相关法分析，以P 0 ．0 5 ) 4 ．膀胱尿路上皮细胞癌中，趋化因子C X C L l 2 分别与其受体C X C R 4 、C X C R 7 的表达呈正相关( P 1 年者定义为吸烟者复发者为二次发病且首次仅行单纯手术治疗者，未予放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗措施实验组纳入病例的特点见表1 表1实验组临床病理学资料( n _ 9 5 )天津医科大学硕士学位论文对象和方法1 ．1 ．2 对照组选取正常膀胱粘膜1 7 例，组织来源为因良性前列腺增生( B P H ) 行开放性手术的患者，术后病理诊断证实为良性前列腺增生伴或不伴前列腺慢性炎症，无恶变1 ．2 实验仪器及主要化学试剂1 ．2 ．1 主要实验仪器表2 主要实验仪器1 ．2 ．2 主要化学试剂①兔抗人C X C L l 2 多克隆抗体( 北京博奥森生物技术有限公司)兔抗人C X C R 4 多克隆抗体( 北京博奥森生物技术有限公司)兔抗人C X C R 7 多克隆抗体( 北京博奥森生物技术有限公司)②P V - 9 0 0 2 超敏即用型两步法( 非生物素) 免疫组化检测试剂盒：A 试剂：3 ％H 2 0 2 ：去离子水B 试剂1 ：聚合物辅助剂( P o l y m e rH e l p e r )天津医科大学硕士学位论文对象和方法C 试剂2 ：辣根酶标记羊抗兔I g G 多聚体( P o l yP e r o x i d a s e - a n t i —R a b b i tI g G ) ·③浓缩型D A B 试剂盒( Z L I 一9 0 3 3 ) ：A 浓缩缓冲液( 2 0 x )B 浓缩D A B 溶液( 2 0 x )C 浓缩过氧化氢溶液( 2 0 x )④P B S 磷酸盐缓冲液( 0 ．0 1M ，p H7 ．2 ～7 ．4 ) ，粉剂。

⑤5 ％B S A 封闭液⑥E D T A 抗原修复液以上产品除一抗外均购自北京中杉金桥生物有限公司1 ．3 实验方法1 ．3 ．1 切片准备( 1 ) 将常规免疫组化所用载玻片先用清洁液除去油脂污物，在酸洗液中浸泡2 4小时，捞出后经自来水反复冲洗，蒸馏水冲洗3 次，烤箱8 0 0 C 烤干；( 2 ) 洁净载玻片置入A P E S 丙酮稀释液( 1 ：5 0 ) 中2 0 - 3 0 秒取出稍停，再入纯丙酮中蘸洗3 次，洗去未结合的A P E S ；( 3 ) 自然晾干，装盒备用( 注意防尘) ；( 4 ) 盖玻片在酸洗液中浸泡6 小时，蒸馏水反复冲洗，无水乙醇冲洗1 次，自然晾干装盒备用( 注意防尘) 1 ．3 ．2 标本的制备与储存组织取下后立即1 0 ％福尔马林固定，常规石蜡包埋5 岬连续切片5 ～6 张1 张作H E 染色外，其余均用经A P E S ( 防脱片剂) 处理的玻片捞片并标一记，于6 0 0 C 恒温烤箱中烤片1 小时，自然冷却后装盒备用H E 染色玻片经两名病理医师分别镜下复查，核实病理诊断与分级、分期1 ．3 ．3H E 染色①二甲苯脱蜡，蒸馏水清洗切片2 次；②将切片浸于苏木精染液染色15m i n ；③0 ．5 ％的盐酸乙醇溶液分化3 0s e c ；④1 ％稀氨水返蓝3 0s e c ；⑤O ．5 ％的伊红复染1m i n 。

上述②固各步骤间均经自来水冲洗2 ～5 m i n 天津医科大学硕士学位论文对象和方法1 ．3 ．4 免疫组织化学( I H C ) 染色操作步骤( 1 ) 切片置于7 0 0 C 烤箱2 小时；( 2 ) 二甲苯I 浸泡脱蜡1 5 分钟；( 3 ) 二甲苯I I 浸泡脱蜡1 5 分钟；( 4 ) 无水乙醇浸泡脱水1 0 分钟；( 5 ) 9 5 ％乙醇浸泡脱水1 0 分钟；( 6 ) 8 0 ％乙醇浸泡脱水5 分钟；( 7 ) P B S 冲洗液洗涤2 分钟×3 次；( 8 ) 3 ％H 2 0 2 室温1 0 分钟以灭活内源性酶；( 1 0 ) 蒸馏水2 分钟×3 次；( 1 1 ) 抗原修复：将切片放入配好的E D T A 抗原修复液中，高压修复( 甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的抗原决定簇如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过高温或强碱处理后，可使交联打开，以提高抗原抗体检测的成功率) ，煮沸后保持2 分钟；( 1 2 ) 取出修复盒，于室温下冷却( 勿将切片自盒中取出) ；( 1 3 ) 液温恢复常温( 约一至两小时) 后，取出切片；( 1 4 ) P B S 液洗涤2 分钟×3 次( 1 5 ) 阻断灭活内源性过氧化物酶：加3 ％H 2 0 2 室温孵育1 0 分钟，P B S 冲洗2分钟×3 次( 1 6 ) 滤纸擦干切片周边多余水分，标本上滴加5 ％B S A 封闭液，于湿盒中室温下孵育1 0 分钟，倾去多余液体( 勿冲洗) ；( 1 7 ) 滴加一抗，涂布均匀后置于湿盒中孵育，4 0 C 冰箱内过夜；( 1 8 ) 次日( 于冰箱内留置约1 8 小时后) ，取出湿盒，室温下放置至恢复常温；( 1 9 ) 切片恢复常温后( 约半小时) 后，以P B S 液洗涤2 分钟×3 次；洗掉残存的一抗( 用P B S 缓冲液代替一抗作阴性对照) 。

2 0 ) 滴加试剂1 ( 聚合物辅助剂，使细胞通透性发生改变，有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗) ，室温或3 7 0 C 孵育2 0 分钟；( 2 1 ) 取出湿盒，室温下冷却至常温后，以P B S 液洗涤2 分钟×3 次；( 2 2 ) 滴加试剂2 ( 辣根酶标记羊抗兔I g G 多聚体) ，室温或3 7 0 C 孵育2 0 - , 3 0分钟；( 2 3 ) 取出湿盒，室温下冷却至常温后，以P B S 液洗涤2 分钟×3 次；天津医科大学硕士学位论文对象和方法( 2 4 ) D A B 溶液显色，lm l 蒸馏水中依次加入显色剂A 、B 、C 各一滴( x 2 0 稀释) ，现用现配，配好后避光保存，3 0 分钟内使用，剩余液体弃去显色时间由预试验确定，显微镜下控制反应时间，出现棕色颗粒立即终止反应，最长显色时间不超过l O 分钟；( 2 5 ) 蒸馏水冲洗；( 2 6 ) 苏木素工作液轻度复染，时间平均为3 0 - - , 4 0 秒；( 2 7 ) 自来水冲洗1 ~ 2 分钟，蒸馏水冲洗；( 2 8 ) 梯度酒精脱水：8 0 ％乙醇5 分钟，9 5 ％乙醇5 分钟，无水乙醇I1 0 分钟，无水乙醇I I1 0 分钟；( 2 9 ) 透明：二甲苯Il O 分钟，二甲苯I Il O 分钟；( 3 0 ) 中性树胶封片，放置室温自然晾干，备显微镜下观察。

1 ．3 ．5 免疫组织化学对照试验采用已知阳性组织切片作为阳性对照，以P B S 溶液替代一抗作为阴性对照1 ．4 免疫组织化学着色结果判断1 ．4 ．1 质量控制每批标本检测时，均设有空白对照( 以P B S 缓冲液代替一抗染色已知阳性切片) 观察染色结果由天津医科大学第二医院、天津市泌尿外科研究所病理室一名病理医师和实验者共同确定1 ．4 ．2 结果判定所有染色切片均在光学显微镜下观察，用病理图文数字扫描系统扫描后保存趋化因子C X C L l 2 及其受体C X C R 4 的表达以细胞膜和( 或) 细胞质中出现清晰棕黄色细颗粒为阳性判定标准，C X C R 7 受体主要表达在细胞质中，以胞质中出现清晰棕黄色细颗粒为阳性判定标准免疫组化结果采用双盲半定量积分法判定：( 1 ) 按肿瘤细胞着色深浅程度评分：O 分为无着色，1 分为浅黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色 2 ) 按阳性细胞所占比例评分，每张切片随机选择1 0 个视野，高倍镜下( 4 0 0X ) 计数每个视野记录1 0 0 个肿瘤细胞并计算阳性细胞百分数，注意避开边缘组织及出血坏死区域结果取l O 个视野的平均百分数，0 分为阳性细胞数的百天津医科大学硕士学位论文对象和方法分比 5 0 ％。

染色强度评分与阳性细胞数评分相加后得出综合评分：t > 4 分为阳性表达( + ) ， 6 56 74 52 26 7 ．2郅5性别男性女性吸烟吸烟不吸烟初复发 初发复发分级G I2 85 0 ．O7 04 32 76 1 ．42 51 696 4 ．06 24 22 06 7 ．73 35 1 ．56 93 53 45 0 ．72 62 429 2 ．33 5l O2 52 8 ．62 ．4 7 20 ．1 1 60 ．0 5 20 ．8 2 02 ．4 1 00 ．1 2 11 3 ．8 7 5O ．0 0 0 ★2 。