肝中DNA的分离与鉴定.doc

肝中DNA的分离与鉴定［冃的］1. 掌握DNA分离纯化的原理和方法2. 熟悉台式离心机的使用3. 掌握DNA定量技术［原理］细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存 在于细胞质中这两类核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具 有很高的溶解度，脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低制成肝匀浆后，用o. 14mol/L氯化钠溶液抽提， 可将两种核蛋白分离分离过程中加入少杲柠檬酸钠，口J抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用SDS（十二烷基硫酸钠）能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS, DNA即与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，HUDNA溶解于水相，垠后用冷乙醇将DNA析出， 而获得纯化的DNA在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相，使离心后的 上层水相，中层变性蛋白，下层有机溶剂相维持稳定DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，蛋门质则在280nm处有很高的吸收峰值利用这 个原理，我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度，可以推算出样品中DNA的浓度，并判断其纯 度。

用标准样品测得在波长260nm处，lug/ml双链DNA钠盐吸光度为0.02,单链DNA钠盐为0.025 （光 程为lcm）,即A260=l时,样品中双链DNA浓度为50ug/ml,单链DNA浓度为40ug/ml纯净的DNA 样品A260/A280的比值约为1.8,样品中含有蛋白质或其它杂质，会使A260/A280的比值下降A260/A280 的比值大于1.6基本能达到各种后继实验的要求［操作］（操作过程可参见流程图）1. 肝匀浆制备：新鲜猪肝，用0.9% NaCI洗去血液，除去结缔纽织，剪碎，称収4g肝纽.织，加4ml 0.14mol/LNaCl溶液,匀浆器中研磨，制成肝匀浆2. 分离核蛋白：2ml肝匀浆倒入试管中，5000rpm离心5min,上淸弃去沉淀加2 ml 0.14 mol/LNaCl 搅匀后再匱匀浆器中研磨，5000rpm离心5min,上清弃去，沉淀重复上述操作，上淸弃去，沉淀为DNA■蛋白质复合物3. 沉淀中加0.14mol/L NaCl 1.0ml,搅匀，滴加5%SDS 1.0ml,边加边搅,60C水浴10 min（不停搅 拌），冷至室温，均匀分成两管为Bl、B234. Bl、B=管中各滴加氯仿一异戊醉液4.0m 1（边加边搅），搅至溶液颜色均匀，5000rpm离心10min3 溶液分三层，上层液为水相（含DNA）,中层为蛋白质沉淀，下层为有机相，吸収Bl、B2上层液合倒于另—•试管中。

5. 上清液加95%冷乙醉4.0ml,潑J (颠倒混匀法)，5000rpm离心lOmin,去上清液，沉淀为纯化DNA6. DNA的溶解：沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 1.0ml,搅拌溶解，5000ipm离心lOmin,上清液则为 DNA水解液7. DNA的测定：用0.1 mol/L NaOH将样品稀释到一•定浓度，以0」nwl/L NaOH调零，测定样品的 A260和A280,计算出每克肝纽织中的DNA含量，并判断纯化DNA的纯度［注意事项］(1) 在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入含0.01 mol /乙柠檬酸钠的0.14mol/L氯 化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防lI.DNA的分解以提高核酸得最2) 齐步骤操作应力求准确，尽嵐减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性+(3) 稀释后应该尽量使样品A260和A280处于0.1-0.7的范围内肝中RNA、DNA的分离与鉴定的操作步骤。