异种克隆牦牛，羚牛及相关机理的研究.pdf

摘要在保护濒危动物和进行核质互作分析方面，异种克隆技术是非常有效的方法本研究利用牛卵母细胞作为受体，通过显微操作与牦牛或羚牛体细胞构建异种重构胚，将牦牛的异种重构胚移植到代孕牛中，获得了妊娠，并有望于2 0 0 4 年6 - - 7 月间出生此外本研究还对异种克隆技术和异种体细胞核重编程进行了初步探讨1 供体细胞的培养：本实验从北京动物园、青海互助县、秦皇岛野生动物园分别采集了羚牛和牦牛组织样，建立了2 1 个细胞系细胞系种类包括耳成纤维细胞、输卵管上皮、颗粒细胞系二种实验证明样品采用0 ℃保存48 小时，对细胞系的建立无负面影响这为野外收集珍稀动物组织，建立细胞系提供了切实可行的方法2 体细胞克隆技术基础平台的建立：首先，在去核方法上，本实验比较了H 3 3 3 4 2 染色法，盲吸法和高渗法并结合这三种方法作了优化．形成本实验的去核方法；其次，本实验利用牛卵母细胞孤雌激活的方法，比较了四种激活方法，发现利用复台激活方法比单个化学试剂激活效率高( 8 36 、6 8 ．7 ：4 5 、6 25 ) ，而在复合激活的方法中以A 2 3 1 8 7 + 6 ．D M A P 激活效率较高( 分裂率，8 3 ．6 ) ；最后．通过比较M 1 9 9 培养液和C R l a a 培养液对孤雌激活胚胎的培养效率，发现C R l a a 培养液较适合牛胚胎的培养。

3 异种克隆牦牛囊胚研究：本实验利用不同个体的牦牛耳成纤维细胞、颗粒细胞和输卵管细胞．分别作为供核细胞移入去核牛卵母细胞中，均可完成体外牦牛的早期囊胚发育( 囊胚率高达3 5 ％) 通过对不同年龄阶段、不同个体、不同细胞类型、细胞的饥饿与否、细胞冷冻与否，以及卵母细胞成熟率，不同融合到激活时间对克隆效率的比较发现：卵母细胞的质量是克隆成功的基础，当成熟率在4 0 ％以下时，将显著影响异种克隆牦牛的囊胚发育( 由2 5 ％降到3 ％，P 1 5 分钟I转移水相到一新离心管中，加入等体积的氯仿，室温混匀1 0 分钟l4 ℃，1 2 0 0 0 r p m 离，5 , 1 5 分钟l转移水相到一新离，C , W q 3 ，加入二倍体积的乙醇和l ，1 0 体积的3 M N a A c ( p H 52 ) 混匀，- 2 0 ℃沉淀2 小时以上I4 V ，i 2 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，用7 5 ％乙醇洗涤沉淀I将沉淀稍干燥后，溶于2 ¨5 0 p l D E P C 水中，取出l p l 测定浓度和纯度，剩余R N A 保存于．8 0 ·C l23e D N A 第一链的合成1 ．2 ，4O c t 4 探针的扩增9 6—垄垄二! ：i 翌! 盟曼：垒量主塑垒坠工垄坌：R N A1 0 0 Np r h n e r ( T 1 8 ，2 5p m o l ／p 1 )1 ．0 ．u ll6 5 ℃变性5 分钟，迅速置冰上，使R N A 变性。

』——————．! 堕壁笪! 垫△工! ! 彗型 5 “e D N Ab u f f e r4 ；丁 O1 M D T I “20 t a l R N a s i n 1 ．0 Nl3 7 ℃延伸5 0 —6 0 分钟l7 0 “ C ，1 5 分钟，终止反应je D N A 可保存于一2 0 ℃保存或立即P C R 一一Table7 , 1P d m e no f o c } 4g e n ef o rR T - P C Rj = ■= = = _ —————————————～一．甄；警型⋯⋯⋯⋯⋯⋯!I麓焦曼⋯攘煞I嘲!o．pi荔王O⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯! i ! ! 曼一弭TL ＼厘LJ ，于，U 亏 c t 4T c c c A G G A C A T C A A A G C T C T3 2 4 —3 4 48 5 2P ．F ' 0 2 2 —9 8 7 ———C T T C —A C —c —' F r c —c c —T C —C A —A —C C —A —1 —8 7 0 —- 1 —8 9 0 ～～中国农业大学博士学位论文O c t 4 基因表达的研究在一0 ．2 5 m l 离心管中加入以下组分H 抑l o ×P C Rb u f f e rM g C h ，d N T PP r i m a l ／p r i m e r 2T a qp o l y m e r a s eC D N A 模板T o t a l1 7 0 u J25 ．1l5L L l20 L l 】05 ，05 山O3 山10 u J2 50 1 山P c R 反应条件：9 4 。

C ，l m i n ：以9 4 ‘C ，3 0 s e c ，5 7 C ，3 0s e c ，7 2 “ C ，3 0 s e c 做3 0 个循环取1 0 u J反应产物用2 ％琼脂糖电泳鉴定l25O c t 4 扩增产物的纯化试剂盒( 道普) 纯化按照5 ：1 的比例往P c R 反应体系中加入D N AB i n d i n gS o l u t i o n ，充分混均l将吸附柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，1 2 0 0 0 r p m 离，L , 3 0 秒l倒掉收集管中的废液，自1 1 ．K 5 0 0lC o l u m l lW a s hS o l u t i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒J重复步骤3 ～次，倒掉收集管中的废液，1 2 0 0 0 ] 一p m 离，C , 3 0 R )I将吸附柱放入一支新的l ·5 m l 离心管中，在吸附管膜中央加入3 0 “1 D P 洗脱液，室温放置2 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟a 离心管中的液体即为回收的P c R 产物，可立即使用或保存于一2 0 ℃备用4取1 “l 电泳，检查回收的效果l26p G E M - TE a s y 载体的连接反应l O p l 连接体系S o l u t i o nI5 ．O u I载体0 ．5 ¨1D N A适量水适量混匀，1 6 ℃水浴连接过夜，准备转化。

1 ．2 ．7 感受态细胞的制各：C a C l 2 法从新鲜平板上挑取E ∞n D H 5 a 单菌落，转到一含有5 0 m I L B 培养基的2 0 0 I n l 的三角瓶中，于3 7℃以2 0 0 r p m 转速摇7 小时左右，直到透过培养基可以模糊看清放在其下的四号字q 7中国农业大学博士学位论文O c t 4 基因表达的研冗l在无菌的条件下将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的5 0 m l 离心管中，在冰上放置1 0 分钟，使培养物冷却到O ℃于4 ℃以4 0 0 0 r p m 离心l o 分钟，以回收菌体^倒出培养液，将离心管倒置，使最后残留的痕量培养液流尽l用1 0 m l0I M o l ／L C a C l 2 ．2 H 2 0 重悬菌体沉淀，冰浴1 5 分钟0于4 ℃以4 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，以回收菌体J倒出培养液，将离心管倒置以使最后残留的痕量洗液流尽l, 用2 m l 冰预冷的0 ．I M o l ／LC a C l 2 重悬细菌沉淀i分装细菌细胞，每管约2 0 0 “1 ，存于．8 0 “ Cl28 感受态效价的测定感受态的效价是指l 瞻质粒D N A 所能转化出来的细菌数，其测定方法为如下：用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取2 0 0 埘转移到无菌的l5 1 n l 微量离心管中，每管加l “l2 0 n g m l 质粒D N A ，轻弹外管壁以混匀内容物，之后于冰上放置3 0 分钟王将管放到预加热到4 2 ℃的水浴中试管架上，放置9 0 秒l快速将管置于冰上，冷, ' 4 1 9 0 秒』每管加8 0 0 p iL B 液体培养基，然后将管转移到3 7 ℃摇床，温育4 5 分钟颠倒离心管数次，各取5 0 ，2 0 0 山涂A m p 板( 其中A n l p 的含量为l O O n g ／m 1 )l将涂好的平板于3 7 ℃培养1 2 —1 6 小时，计数平板上菌落的数目，然后根据公式E ：1 0 0 0 州( 5 0 p 1 )及E 2 2 5 0 + N ( 2 0 0 p I ) 进行计算，其中N 代表L B 平板上菌落的数目。

取两个E 的平均值即可作为其效价l2 ．9 质粒D N A 的转化；遵循感受态细胞效价的测定方法12 ．10 质粒D N A 的快转法：中国农业大学博士学位论文O c t 4 基因表达的研究从一7 0 C 超低温冰箱取2 0 0 “l 感受态细胞{加入1 0 9 l 连接产物．在3 7 C 放置l O 分钟l涂于热平板( 3 7 * ( 2 ) ，过夜培养l211 重组质粒的快速鉴定C r a c k i n g 法挑取转化后的菌落在新鲜的含A m p 平板上划线，置平板于3 7 “ ( 2 培养大约1 2 d ' 时i取一批E p p e n d o r f 管，编号，每一管内加入1 0 山灭菌双蒸水』用灭菌牙签挑取一团划线菌落置于编号的离心管4 -振荡离心管，使菌体均匀地分散在水相中l加入1 0 u l2 ×C r a c k i n gb u f f e r ，剧烈振荡l1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟I取上清电泳l2 1 2 质粒D N A 或粘粒D N A 的小量制各将3 “含抗生素( 6 0 —8 0 n ∥m 1 ) 的L B 培养基加入到容量为l O m l 通气良好的试管中，然后接入转化后的单菌落，3 T C 摇床培养过夜l将1 ．5 m l 菌液倒入1 ．5 m l E p p e n d o r f 管0 0 ，1 2 0 0 0 r p m 离，t i , , 3 0 I u ) ，收集菌体l将菌体沉淀重悬于05 m lS T E q b ，振荡洗涤，重新离心收集菌体I加入1 0 0 ¨l 冰预冷的溶液I ，剧烈振荡l加入2 0 0 Ⅲ新配制的溶液I I ，缓慢颠倒2 —3 次，静置1 —2 分钟，待溶液变得清亮l加入1 5 0 p l 冰预冷的溶液I I I ，缓慢颠倒数次，将管于冰上放置1 0 分钟l用微量离心机于4 ℃，1 2 0 0 0 r p m 离心l O 分钟，N 上N N N N N 一离心管中l加等量酚：仿，充分摇荡1 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟．将上清转移到另一离心管中9 9中国农业大学博士学位论文O c t 4 基因表达的研究加等量的氧仿，充分摇荡l O 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离，t ：, 1 0 分钟，将上清转移到另一离心管中加入2 倍体积的乙醇，振荡混匀，一2 0 。

C 冰箱放置- - 4 , 时以1 2 0 0 0 r p m 离, D 1 5 分钟吸弃上清．用7 0 ％的乙醇洗涤D N A 沉淀数分钟吸弃7 0 ％乙醇溶液，真空抽干2 分钟溶于2 0 p 1 灭菌双蒸水中，加入l p l l O m g ／m J 的无D N a S e 的R N a s e ，3 7 ℃水浴放置l 小时取l g lD N A 泳，检查质粒提取的效果1 , 2 ．1 3 质粒D N A 或粘粒D N A 的大量制备及纯化( 碱裂解法)1 0 0将一单菌落接入含A m p 的2 0 0 m I L B 液体培养基中，3 7 ℃培养过夜将细菌培养液移入5 0 m j 的离心管，Y ' 4 “ C 8 0 0 0 r p m 离心5 分钟回收菌体倒掉上清·将菌体沉淀重悬于l O m l 冰预冷的S T E 中，充分振荡洗涤4 “ C ，8 0 0 0 r p m 离心5 分钟重新回收细菌] J 口A l m l 冰预冷的溶液I ，剧烈振荡加入2 m l 新配制的溶液I I ，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，于室温放置6 分钟, 自f f A l5 m l 冰预冷的溶液I I I ，用混合液缓缓自下而上浸润。