实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定.ppt

实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定（酶活力、纯度及分子量测定）1实验内容1. 溶菌酶的粗提取2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定2背景知识溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活34溶菌酶理化性质：溶菌酶理化性质：相对分子质量相对分子质量14700 Da，由，由129个个氨基酸氨基酸残基构残基构，，pI:~10.8，最适温度为，最适温度为50℃，最适，最适pH为为6～～7左右280nm的消光系数的消光系数为为13.05背景知识：背景知识：酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化l初步纯化初步纯化（（rough fractionation）） （提取）：（提取）：把酶从把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液 l高度纯化高度纯化（（fine fractionation）） （精纯化）：除去与（精纯化）：除去与产物性质相似的杂质产物性质相似的杂质l纯化方案评价纯化方案评价：：酶活力酶活力、、蛋白浓度蛋白浓度、、纯度纯度6        粗纯化（粗纯化（ 提取）目标：提取）目标：￿￿￿￿￿￿a.￿￿将目的酶最大限度地溶解出来￿￿￿￿￿￿b.￿￿保持生物活性l注意：温度升高，溶解度加大但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作提取原则提取原则a.￿相似相溶b.￿远离等电点的pH值，溶解度增加7离心分离离心分离（（一）一）基本原理基本原理1. 1. 离心力离心力     Fc = m ac ＝＝ m r r ωω2 2 ＝＝ m r r （（2  N/60））2 2         N为离心机为离心机每分钟转数每分钟转数 （（r/min ））；；        Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（（relative centrifugal force）表）表示，示，即离心力即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少）的多少倍倍。

一般用一般用g g（或数字（或数字 g g）表示RCF = RCF = m r r （（2  N/60））2 2 /mg= 1.12 = 1.12  1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用旋转半径用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（（r r大大+r+r小小））cmcm 8 通常：通常：•低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min•高速离心（超速），常以高速离心（超速），常以相对离心力相对离心力（（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g 两者可换算或查测算图两者可换算或查测算图9名称名称 转速转速(r/min)(r/min) 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机  60006000 常温，注意样品热变性和离心常温，注意样品热变性和离心管平衡管平衡 高速离心机高速离心机 6000〜 〜 25000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 >25000冷冻＋真空系统（减少空气阻冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类离心机的种类 10离心的形式离心的形式l角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。

角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速 l                            角式由低速到超速均有角式由低速到超速均有 11角式离心机和离心头（转子）角式离心机和离心头（转子）l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧注意稳、盖、旋紧12离心管离心管l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套l高速超速管高速超速管要加盖要加盖13离心机操作离心机操作l平衡、定温、定速、定时平衡、定温、定速、定时14实验一、实验一、 溶菌酶的粗提取溶菌酶的粗提取——略略15u 酶精纯化常用技术l膜分离技术l柱层析技术l蛋白质结晶透析超滤凝胶过滤（分子筛/排阻）层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析反相层析16Principles of Operation for Chromatography TechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase17实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定目的：1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原件。

2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活18l原理：l      根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的l溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟）OD600值的下降评价酶活性l溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，OD600每分钟降低0.001为1个活力单位l280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶浓度，用于酶比活的评价19离子交换层析离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC）202.离子交换填料离子交换填料：： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成 纤维素纤维素  琼脂糖琼脂糖  葡聚糖葡聚糖 载体载体 电荷基团电荷基团 —O O—CHCH2 2—COOCOO- -—NaNa+ +反离子反离子1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。

21离子交换剂离子交换剂--带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载载体体Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂(可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质)  阳离子交换剂阳离子交换剂(可吸附可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质)22两种离子交换剂两种离子交换剂l阴离子交换剂：阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基l阳离子交换剂：阳离子交换剂：l常用羧甲基常用羧甲基       CM        —CH2COO－－ l磺丙基磺丙基               SP          —C3H6SO3－－DEAE        －－C2H4N+(C2H5)2HQAE          －－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH323               化学原料合成化学原料合成 ：： sephadex  sepharose 载体载体               天然材料制成：天然材料制成： cellulosecellulose                                                                                                                                                      如：如：DEAE-Sepharose，， CM-Sepharose24  实验设计原实验设计原理理 利用不同的蛋白利用不同的蛋白质质分子在溶液中所分子在溶液中所带电带电荷荷不同，因而不同，因而与离子交换剂与离子交换剂有不同吸附力而有不同吸附力而分离。

分离pH8.0pI > 8.0 蛋白蛋白质带质带正正电电pI < 8.0 蛋白蛋白质带负电质带负电溶菌酶溶菌酶pI:~10.8252. 阴离子交换剂分离蛋白质阴离子交换剂分离蛋白质的的过程过程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分离结束分离结束再生再生+低低盐盐高高盐盐利用不同利用不同盐浓度将盐浓度将不同蛋白不同蛋白质质洗洗脱下脱下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-263. 操作操作    平衡平衡     上样上样    冲洗冲洗    洗脱洗脱     再生再生1）上样：）上样：上样体积不十分严格上样体积不十分严格2）洗脱）洗脱: 增加溶液的离子强度增加溶液的离子强度 梯度洗脱法梯度洗脱法 （连续、不连续）（连续、不连续）改变溶液的改变溶液的pH值值  3）再生：）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液处理溶液处理4.4.应用应用 制备纯化生物大分子制备纯化生物大分子27梯度洗脱方式28图图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线梯度溶液的制备方法和洗脱曲线（（a）线性梯度；（）线性梯度；（b）凸形梯度；（）凸形梯度；（c）凹形梯度；（）凹形梯度；（d）编程梯度）编程梯度29  层析柱的制备与层析操作层析柱的制备与层析操作       柱层析的设备柱层析的设备:       层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。

部分收集器、梯度洗脱器30层析设备层析设备l层析装置：层析装置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕动泵蠕动泵l 层析柱层析柱l 监测仪监测仪l 记录仪记录仪l 收集器收集器 31记录仪记录仪32现代化层析设备——AKTA层析柱层析柱XKBPG实验2.1 层析柱的填装l1.观摩l2.实验步骤l1）测定酶浓度（S-2）lC(mg/ml)=A280/13l2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋白需要的填料量和量取量34l3）装柱要点：la. 用纯水将乙醇保存液置换lb. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏lc. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底ld. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中35二、酶的活力单位及酶活测定：二、酶的活力单位及酶活测定：1. 1. 酶酶活活单单位位：：19611961年年国国际际生生化化协协会会酶酶学学委委员员会会统统一一规规定定，，酶酶的的国国际际单单位位（（IUIU））规规定定为为：：在在最最适适反反应应条条件件（（温温度度25℃25℃））下下，，每每分分钟钟内内催催化化1 1微微摩摩尔尔（（μmolμmol））底底物物转转化化为为产产物物所所需需的的酶酶量量（（或或1 1分分钟钟内内转转化化底底物物生生成成1 1微微摩摩尔尔产产物物的的酶酶量量））称称为为1 1标标准单位准单位。

2.2.酶的比活力：酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数每单位酶蛋白所含的活力单位数 对对固固体体酶酶：：用用活活力力单单位位/mg/mg酶酶蛋蛋白白、、或或活活力力单单位位/mg/mg酶蛋白氮来表示；酶蛋白氮来表示； 对对液体酶液体酶：用活力单位：用活力单位/ml/ml酶液来表示酶液来表示 很明显，比活力越大，酶的活力越大很明显，比活力越大，酶的活力越大37分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法或产物有紫外吸收的能力可采用此法测压法：产物中有气体，测气压增加量测压法：产物中有气体，测气压增加量滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法反应生成荧光产物可用此法旋光法：产物中有旋光物质可采用此法旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。

除了以上方法外，还可根据除了以上方法外，还可根据产物的性质产物的性质采用其它方法采用其它方法 3.具体测定方法具体测定方法4. 回收率和纯化倍数回收率和纯化倍数回收率＝回收率＝                               ×100％％提纯后酶总活力提纯后酶总活力提纯前酶总活力提纯前酶总活力纯化倍数＝纯化倍数＝每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力实验实验2.2溶菌酶的活性测定溶菌酶的活性测定实验材料：实验材料：1. 枯草芽孢杆菌悬液枯草芽孢杆菌悬液2. S1，，S23. PBS等等4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等分光光度计、比色皿、计时器、离心机等40实验步骤：实验步骤：1. 取取6ml 菌悬液，菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬2. 测定测定OD600并记录（吸光度并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释），若读数过高可适当稀释）3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入）入）比色皿1234PBS缓冲液/ml5---细胞PBS悬液/ml-54.84.8酶液S1/ml--0.2酶液S2/ml0.241实验步骤：实验步骤：4. 酶活性测定，以酶活性测定，以①①管（管（PBS）为对照，每隔）为对照，每隔30s 测定测定2,3,4管的管的OD600并记录并记录5. 酶活力及比活性计算：酶活力及比活性计算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136. 纯化回收率及纯化倍数计算纯化回收率及纯化倍数计算时间（s）03060901201501802号       3号       4号       回收率＝回收率＝                               ×100％％US2*V2US1*V1纯化倍数＝纯化倍数＝S2比活力比活力S1比活力比活力42样品体积ml蛋白浓度mg/ml总蛋白  mg活力  u/ml比活力  u/mg总活力  U回收率%提 纯 倍数 S1V1＝     1001S2V2＝       7. 完成下表完成下表43实验实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定实验目的实验目的:1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶（烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；2、掌握电泳原理以及、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳垂直板电泳分析分析蛋白质技术；蛋白质技术；3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，SDS-PAGE分子量测定分子量测定图谱的绘制与计算；图谱的绘制与计算；4、了解在电泳中分子量标准物的使用。

了解在电泳中分子量标准物的使用44SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚丙烯酰胺凝胶电泳  十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称）简称SDS－－ PAGE 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（（relative molecular mass, Mrrelative molecular mass, Mr）测定1.1.原理原理451.1.原理原理        SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异 SDSSDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－质－SDSSDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），长轴与蛋），长轴与蛋白质分子量成正比。

白质分子量成正比 因此，因此，蛋白质蛋白质—SDSSDS复合物复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关蛋白质分子量）有关46 SDS-PAGE separates proteins by MW47 蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：系，符合下式：logMW=K-bXlogMW=K-bXMWMW：：分子量；分子量；X X：迁移率；：迁移率；k k、、b b均为常数均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量可在标准曲线上求得分子量48492. 分离效应分离效应  PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（连续电泳（continuous electrophoresis）） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（不连续电泳（discontinuous electrophoresis））  采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE50不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳          凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

径的分离胶l浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离带，然后再进入分离胶进行分离l电荷效应电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同迁移率不同l分子筛效应分子筛效应 ：：大小和形状不同的样品分子通大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率表现出不同的迁移率   2. 实验步骤：实验步骤：（（SDS-PAGE））1）母液配制）母液配制2））制胶准备制胶准备: a.玻璃板清洗、干燥玻璃板清洗、干燥 b.制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动及其他设施偏离工作要求及其他设施偏离工作要求及其他设施偏离工作要求及其他设施偏离工作要求522. 实验步骤：实验步骤：（（SDS-PAGE））3））制胶制胶: a.分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择15%的分离胶，如表配制的分离胶，如表配制53浓缩胶（10 ml）双蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%胶贮液10% SDSTEMED10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 μl5 μl50 μl分离胶（20 ml）双蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl胶贮液10% SDS TEMED10% AP12%3.3ml2.8ml2.5 ml2.0ml4 ml5 ml100 μl4 μl100 μl543、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之左右，之后加少许蒸馏水，静置后加少许蒸馏水，静置30分钟。

凝胶配制过程分钟凝胶配制过程要迅速要迅速，催化剂，催化剂TEMED要在注胶前再加入要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶注胶过程最好，否则凝结无法注胶注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡水封的目的是为了使分离胶上延平一次性完成，避免产生气泡水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的直，并排除气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘续平稳加入浓缩胶至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置处，迅速插入样梳，静置10分钟样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平5、电泳液缓冲（、电泳液缓冲（*10）配制：）配制：30g Tris, 150g Gly, 10g SDS+800ml dH2O, 定容至定容至1000ml555、样品处理：取、样品处理：取30ul样品（样品（S1，，S2），加入），加入30ul 上样缓冲液，上样缓冲液，100℃水浴水浴30min，，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。

否则会影响加样效果6、加样、加样3个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白加入相应体积的样品和蛋白Marker其中蛋清（其中蛋清（S1）和）和Marker加样加样量为量为2 µl，，S1、、S2、、S3、和、和S4加样量为加样量为10 µl为了练习和比较上样量为了练习和比较上样量的影响，可以加的影响，可以加20 µl的的S1～～S2作为对照注射器不可过低，以防刺作为对照注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散为避免边缘效应，最破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样好选用中部的孔注样567、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在在160 V，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为240 V，溴酚蓝距凝胶边缘约，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳时，停止电泳8、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，染色液，42℃染色染色40 min左右。

剥胶时要小心，保持胶完好无损，左右剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分染色要充分9、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰直到蛋白质区带清晰 10、将凝胶照相并进行分子量分析、测定将凝胶照相并进行分子量分析、测定57将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取于白色背景上，用直尺量取marker中各条带中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线：制分子量标准曲线： logMW=K-bX logMW=K-bX以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量子量58电泳胶实例59思考题1. 层析柱填装的注意事项2. 分光光度法测定溶菌酶活力的原理是什么？注意事项有哪些？3. P140 1-460实验报告格式及要求1.内容完整2.报告表头（包括时间、地点、同组人员）【实验目的】全【实验原理】全【实验材料】操作者【实验步骤】操作者【实验结果】操作者【分析讨论】操作者【思考题】 全61。