动物细胞大规模培养(1).ppt

第五章第五章 动物细胞的大规模动物细胞的大规模培养培养一、概述一、概述二、方法和操作方式二、方法和操作方式三、动物细胞生物反响器三、动物细胞生物反响器本章内容提要本章内容提要.概述概述 在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的开展前景根本概念：动物细胞大规模培养技术：指在人工条件下，在细胞生物反响器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术人工条件-既满足培养过程必需的营养要求，还要进行pH和溶解氧的最正确控制.动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗疫苗人人小小儿儿麻麻痹痹症症疫疫苗苗、狂狂犬犬疫疫苗苗、风风疹疹疫疫苗苗、脑脑炎疫苗、疱疹疫苗等炎疫苗、疱疹疫苗等动物动物牛牛病病毒毒性性腹腹泻泻疫疫苗苗、牛牛痢痢疾疾疫疫苗苗、犬犬传传染染性性肝肝炎炎疫疫苗苗、鸡鸡痘痘病病疫疫苗苗、猪猪霍霍乱乱疫疫苗苗、牛牛疫疫狂狂犬犬疫疫苗苗、草草鱼鱼出出血血热疫苗热疫苗单克隆抗体单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂免疫调节剂-细细胞胞生生长长因因子子、干干扰扰素素、白白细细胞胞活活化化因因子子、血血清清胸胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶酶尿尿激激酶酶、天天门门冬冬氨氨酰酰胺胺酶酶、胶胶原原酶酶、细细胞胞色色素素P、450、纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原激激活活剂剂、胃胃蛋蛋白白酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶、酷酷氨氨酸脱羟酶等酸脱羟酶等激素激素绒绒膜膜促促性性腺腺激激素素、促促红红细细胞胞生生成成素素、促促滤滤泡泡激激素素、生生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等.大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养工工艺艺流流程程图图细胞培养反响器细胞培养反响器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品肿瘤抗原产品肿瘤抗原纯化纯化产品干扰素产品干扰素纯化纯化提取提取产品单克隆抗体产品单克隆抗体浓缩纯化浓缩纯化79865432110.性质性质动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞大小大小代谢调节方代谢调节方式式营养要求营养要求生长速率生长速率机械强度机械强度环境适应性环境适应性10-100um内部和激素内部和激素苛刻苛刻倍增时间一般为倍增时间一般为12-60h很差，缺乏保护性细胞很差，缺乏保护性细胞壁壁差差10um内部内部宽松，可利用多种底宽松，可利用多种底物物倍增时间一般为倍增时间一般为0.5-2h较好较好好好1、动物细胞与微生物细胞的性质比较、动物细胞与微生物细胞的性质比较 第二节第二节大规模培养的方法和操作方式大规模培养的方法和操作方式.2、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控制控制添加酸、碱添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液缓冲液搅拌速度搅拌速度速度快、范围广速度快、范围广较慢较慢溶氧控制溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度度改变进入气体的氧改变进入气体的氧浓度浓度培养基灭菌方培养基灭菌方法法高温蒸煮高温蒸煮过滤过滤培养时间培养时间几小时几小时几天几天几天几天3、4周周对水纯度的要对水纯度的要求求较低较低很高很高.二、动物细胞培养方法二、动物细胞培养方法贴壁培养贴壁培养悬浮培养悬浮培养固定化培养固定化培养.1.1.贴壁培养贴壁培养 是是指指必必须须贴贴附附在在固固体体介介质表成上生长的细胞培养。

质表成上生长的细胞培养贴壁培养：贴壁培养：旋转瓶培养旋转瓶培养中空纤维培养中空纤维培养细胞工厂培养细胞工厂培养微载体培养微载体培养.微载体悬浮培养系统微载体悬浮培养系统 微微载载体体培培养养定定义义：用用微微珠珠作作载载体体，使使单单层层动动物物细细胞胞生生长长于于微微珠珠外外表表，可可在培养液中进行悬浮培养在培养液中进行悬浮培养微微载载体体：贴贴壁壁培培养养动动物物细细胞胞的的载载体体微微珠反响器反响器:可用与悬浮培养相同设备可用与悬浮培养相同设备.优点：比外表积大；生长条件优点：比外表积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于别培养的优势，取样方便；易于别离缺点：连续搅拌损伤载体外表缺点：连续搅拌损伤载体外表细胞；培养后期细胞容易脱落细胞；培养后期细胞容易脱落实心微载体实心微载体大孔微载体大孔微载体.2.2.悬浮培养悬浮培养 是是指指细细胞胞在在培培养养器器中中自自由由悬悬浮浮生生长的过程长的过程6 6、悬浮培养的优点、悬浮培养的优点增加培养细胞与培养液的接触增加培养细胞与培养液的接触面面及时带走培养物产生的有害代及时带走培养物产生的有害代谢产物谢产物保证了氧的充分供给保证了氧的充分供给.3.3.固定化培养固定化培养 是是既既适适用用于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，又又适适用用于于非非贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞的的包包埋埋培培养养方式。

方式3、固定化培养、固定化培养 固固定定化化培培养养是是既既适适用用于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，又又适适用用于于非非贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞的的包包埋埋培培养养方方式式，具具有有细细胞胞生生长长密密度度高高、抗抗剪剪切切力和抗污染能力强等优点力和抗污染能力强等优点由由于于所所培培养养的的细细胞胞的的不不同同，固固定定化化培培养养的的方方式式也也有有不不同同，一一般般对对于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞通通常常采采用用胶胶原原包包埋埋，而而对对于于非非贴贴壁壁依赖性细胞那么常用海藻酸钙包埋依赖性细胞那么常用海藻酸钙包埋常常用用的的细细胞胞固固定定化化的的方方法法主主要要有有吸吸附附、共共价价贴贴附附、离离子子/共价交联、包埋和微囊化等共价交联、包埋和微囊化等大规模培养技术的操作方式大规模培养技术的操作方式1分批培养；2流加培养；3半连续培养；4连续培养；5灌流式培养1、分批式培养、分批式培养定义分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反响器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养在在细细胞胞分分批批培培养养过过程程中中，不不向向培培养养系系统统补补加加营营养养物物质质，而而只只向向培培养养基基通通入入氧氧，能能够够控控制制的的参参数数只只有有PH、温温度度和和通通气气量量，因因此此细细胞胞所所处处的的生生长长环环境境随随着着营营养养物物的的消消耗耗和和产产物物、副副产产物物的的积积累累时时刻刻都都在在发发生生变变化化，不不能能使使细细胞胞自自始始至至终终处处于于最最优优的的条条件件下下，因因而而分分批批培培养养并并不不是是一一种种很很好好的的培培养养方方式。

式0时间时间分分批批分批式培养过程的特征分批式培养过程的特征营养物营养物废产物废产物PH、温度、温度、DO.0培养时间（d）细胞密度分批式培养的生长曲线对数生长期对数生长期减速期减速期平稳期平稳期衰退期衰退期延滞期延滞期为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？问题问题 细细胞胞分分批批式式培培养养的的生生长长曲曲线线如如下下图图在在分分批批式式培培养养过过程程中中，细细胞胞的的生生长长可可分分为为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段2、流加式培养补料分批式、流加式培养补料分批式 定义流加式培养是指先将一定量的培养液装入反响器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物流流加加式式培培养养只只是是向向培培养养系系统统补补加加必必要要的的营营养养成成分分，以以维维持持营营养养物物质质的的浓浓度度不不变变由由于于流流加加式式培培养养能能控控制制更更多多的的环环境境参参数数，使使得得细细胞胞生生长长和和产产物物生生成成容容易易维持在优化状态。

维持在优化状态流加式培养有何特点？流加式培养有何特点？P102问题问题0时间流加流加式培养过程的特征流加式培养过程的特征PH、温度、温度、DO废产物废产物营养物营养物.根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式：无反响控制流加和有反响控制流加无反响控制流加包括定流量加和间断流加等；有反响控制流加一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等3、半连续式培养、半连续式培养 半连续式培养又可称为反复分批式培养，是指在分批式培养的根底上，将分批培养的培养液局部取出，并重新补充参加等量的新鲜培养基，从而使反响器内培养液的总体积保持不变的培养方式定义.4、连续式培养、连续式培养 连续式培养是指将细胞种子和培养液一起参加反响器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断参加反响器内，另一方面又将反响器液连续不断地取出，使反响条件处于一种恒定状态定义与与分分批批式式培培养养和和半半连连续续式式培培养养不不同同，连连续续式式培培养养可可以以保保持持细细胞胞所所处处的的环环境境条条件件长长时时间间地地稳稳定定，可可以以使使细细胞胞维维持持在在优优化化的的状状态态下下，促促进进细细胞胞的的生生长长和和产产物物的的形形成成。

由由于于连连续续式式培培养养过过程程中中连连续续不不断断地地收收获获产产物物，并并能能提提高高细细胞胞密密度度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞请比较半连续式培养和连续式培养？请比较半连续式培养和连续式培养？问题问题.细胞灌流细胞灌流式培养系式培养系统实例统实例液位控制液位控制细细胞胞悬悬液液细细胞胞新鲜培养基新鲜培养基收液收液过滤器过滤器细胞培养系统细胞培养系统动物细胞的连续培养一般是采用灌流培养灌流培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续向反响器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反响器内，使细胞处于一种营养不断的状态当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物灌流培养时用新鲜的培养液进行灌注，可以确保上述目的的实现通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下灌流培养过程的特征如下图0时间灌注灌注培养过程的特征PH、温度、温度、DO废产物废产物营养物营养物不同培养方式对不同培养方式对CHO细胞生产人细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂组织血纤维溶酶原激活剂tPA)产产量和活性的影响量和活性的影响细胞培养方式细胞培养方式分批培养分批培养半连续培养半连续培养灌注培养灌注培养纯化利率，%82165纯化物质的相对产量11.337.74比活性，IU/mgtPA114.4391.3392.6采采用用灌灌注注培培养养的的优优越越性性不不仅仅在在于于大大大大提提高高了了细细胞胞生生长长密密度度，而而且且有有助助于于产产物物的的表表达达和和纯纯化化。

如如表表及及图图所所示示，因因此此，灌灌注注培培养养已已经经应应用用于于许许多多不不同同的培养系统中，规模已达几百升的培养系统中，规模已达几百升说说灌注培养的优越性说说灌注培养的优越性？问题问题.第三节第三节动物细胞生物反响器动物细胞生物反响器.1、通气搅拌式细胞培养反、通气搅拌式细胞培养反响器响器 工作原理工作原理:反响器运转反响器运转时，圆筒以时，圆筒以30-60r/min的速度转动，的速度转动，由于离心力的作用，搅由于离心力的作用，搅拌器中心管。