藻种培养方法.docx

藻种培养方法一、 藻种的两种培养类型 一般来说藻种的培养有两种方式：一种是长期保存所需要的培养方法，一种是以实验为目的，短期内保藏 藻种的培养方法长期培养最主要的问题是选择一种合适的培养基，可以在 3个月到一年的时间内连续培养藻种最适合长 期培养藻种的培养基是agar （固体琼脂培养基），但是使用agar有一个弊端，即培养物保持无菌的问题； 我们可以加一层蒸馏水（咸水的藻类可以加灭菌过人工的海水）在agar 上,这种做法可以保证在长期保种 的过程中减少agar水分和营养的流失长期保种使用的培养基，不要选择营养过于丰富的，因为多数的藻， 尤其是丝状藻，在营养丰富的环境生长，会发生形态结构上的变化，如果要做生理生态方面研究，实验材 料的形态结构是不能异常的适合长期保种的贫营养的培养基有这些：Bold' s基础培养基，以及该培养基加上蛋白胨或者琼脂制成的a gar，适合长期培养绿藻；Allen及其改良后的配方可以长期培养一般常见的蓝藻和绿藻；土水培养基和它 的一个改良的系列也实用培养多数藻种对于我库提供的藻种，由于藻种长期习惯的原因，建议使用我们 提供的原配方来培养，在长期培养的时候，可以适当稀释原培养基，在藻种培养过程中，生长速率会变慢， 可以保持其形态结构不变。

另外，长期培养的时候，除了选择适当的培养基，还可以降低温度5〜8 C （降温的过程最好能循序渐进， 突然改变环境温度，可能会导致藻种不适应而死亡）光照强度可以减小为原先的一半在实验之前 3到 4 周，将长期培养的藻种接种到我们提供的培养基中（培养基必须灭菌），按照我们给予的培养条件培养， 在实验前6 天左右，再次接种短期培养则可以直接按照我们提供的培养基和培养条件培养由于试验的需要，常常要求在短期时间 内获得大量的培养物，我们可以采用通气培养和摇床培养通气培养可以通 CO2 或洁净的空气，视培养物 的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气， 如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜使用摇床培养，需要注意藻种的生理周期二、 培养基的选择和配制1、培养基的选择① BG11是我库培养蓝藻使用最广泛的培养基除了极少部分蓝藻，大部分都使用BG11按照我们给的配 方配制好后高压灭菌，BG11经常会产生絮状沉淀这是因为其中有Ca+和C032-我们可以在灭菌后再超净 台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种通常我们建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存， 在配置好 BG11 的工作液并灭菌之后，在超净台上用注射器将氯华钙加入。

② SE是我库用来培养常见的绿藻所使用的培养基一般来说，如果配制了母液，用母液来配培养基，灭 菌后是不会产生沉淀的配置的时候注意先将所需要的蒸馏水准备好，将需要的药品逐个加入，等到一种 药品充分溶解之后再加入第二种另外，土水在蒸馏过滤后，是不需要灭菌的，因为高压灭菌的过程会让 其中的一些营养成分损失③ 水是培养基成分中很重要的一个方面配培养基，可以取蒸馏水、自来水、去离子水，也可以取藻种采 集地的水使用经过处理的水，如双蒸水、去离子水，有时候并不合适培养，因为仪器在处理过程中会带 入微量的有毒物质采集藻种采集地的水来培养是最理想的，但是需要经过一些处理，处理的手段和过程 要尽可能保持其营养成分不变如果是咸水或者海水的藻类采集地采集的水，应将其置于5°C的黑暗中， 保持6个月如果是泉水或者湖水等淡水的水源，水样置于20C的室温，立即通过活性炭方法处理：每升 水加 2g 活性炭，搅拌一小时后，过滤，并重复此过程 3〜4 次④ 咸水和微咸水的藻类需要的人工咸水的合成效果关键在于如何蒸馏；还有一些水华蓝藻难以培养，主要 原因是因为在野外生长时，通常底泥提供的营养元素可以溶在水中，但是在实验室培养，经过高压灭菌， 很多营养都损失了。

所以我们建议不用高压灭菌法，使用巴斯德（pasteur）灭菌方法：加热到73〜78 C， 保持15〜20分钟，间隔24小时灭菌一次，一共三次2、培养基的配制 主要介绍一下培养基的配制方法和灭菌方法：1. 配制贮液 培养基一般由三个方面组成：微量元素、大量元素、维生素准备100ml〜200ml的试剂瓶若干，洗净，灭菌 按照我们提供的培养基配方中贮液的浓度，配制大量元素和微量元素的贮液放在以上准备的试剂瓶（遇光 易反应的药品，请放在棕色试剂瓶），置于4°C左右的冰箱保存将需要使用的维生素（最好是针剂）， 也置于4°C左右的冰箱保存2. 配制培养基一般可以配制1000ml左右的培养基留待使用先准备1000ml大烧杯，洗净按照我们培养基配方中的wo rking solution，先加入需要的蒸馏水，然后用移液管向其中加配制好的贮液（注意，不可先加贮液，最 后加蒸馏水）一边加，一边搅拌，依次加入所有组分，最后留下维生素不加三、 灭菌① 、 对培养器材的灭菌： 灭菌在藻种的培养中，是十分重要的一个环节藻种培养、转接、培养基制备等等，任何一个环节都必须 使用灭菌的器械，否则藻种都会染菌，甚至染上其它的藻类。

所有的培养藻种所需要的三角瓶、试管，烧杯，接种环，吸管，注射器，针头等培养，转接藻种所需要的 器材都必须经过高压灭菌，配制培养基所需要的移液管、用来装培养基所需要的瓶也必须经过灭菌，转接 藻种需要的滴管、接种环、涂布所需要的玻璃棒、培养皿等都必须灭菌培养所需要的三角瓶、试管、培养皿，灭菌前洗净，三角瓶可以用牛皮纸内衬粗滤纸来包住瓶口，用棉线 缠紧；或者自做棉塞，外部再加上牛皮纸包住；试管必须和棉塞或者试管塞一起用牛皮纸包好灭菌培养 皿可以5〜10个一起用牛皮纸包好灭菌移液管、滴管、接种环都可以分别用牛皮纸包好灭菌所有玻璃 器皿都采用高压灭菌：在1.5大气压下保持30分钟使用之前不能在敞开的环境打开，只能在超净台打开 灭菌结束后，放在烤箱烘干所有灭菌后的器皿、培养基只能在超净台打开使用 使用巴斯德灭菌法灭菌的原水，也不能在超净台之外的地方打开使用 长期没有使用了但曾经灭菌过的器材或培养基，如果需要使用，必须重新灭菌一次② 、培养基灭菌注意事项： 配制培养基的时候一些经过高压灭菌成分会发生改变的微量元素，应在灭菌后在超净台上用灭菌的注射器 添加如维生素，但是维生素的灭菌也必须很严格，往往藻种污染到细菌都是因为维生素引起的，可以使 用0.22刚或0.45刚的滤膜来过滤维生素溶液。

土水（土壤侵出液）在蒸馏过后只能使用过滤的方法灭菌，不能经过高温高压灭菌洗净若干带橡皮塞的盐水瓶（800ml或500ml），将培养基注入，塞上橡皮塞然后剪一小块纱布，包在橡 皮塞外面，用棉线将塞子和瓶子缠紧，这样保证在灭菌的过程中，培养基不会把橡皮塞冲开最后在橡皮 塞头上插一个小针头，这个做法可以在灭菌的时候放气，也是为了保证培养基不会在灭菌的时候把橡皮塞 冲开然后开始灭菌灭菌结束后，立即降针头拔出将培养基放置在洁净的地方，免受污染四、 藻种培养条件1 、 光照培养一个藻种最初，先将少量的藻种转接到新鲜的培养基中，放在冷白荧光灯管（200—400footcandle） 保持7〜10天，观察最初的生长状况生长较好以后，移到低光照区域（50—100footcandle），保持低速 率的生长实验需要的藻种的培养中，我们推荐使用冷白荧光管来作为光照来源因为如果使用白炽灯泡和直射的日 光作为光源的话，光照会产热，改变培养的温度在阳光照射下培养温度通常可以上升1O°C，如果一定需 要日光作为光源，应将培养物放置在窗前，窗上用纸挡住培养的时候，光照与培养物的细胞密度也有关，一般密度比较小的时候，不适合使用较强烈的光照。

我库 提供的藻种，在细胞密度在105数量级左右时，我们推荐在20001UX的光照下培养接种后，细胞密度很低 的情况下，需要放置在弱光照下培养，随着细胞密度增大，逐渐加强光照培养藻类，每天要定期给一段时间的置于黑暗中培养大多数藻种的光暗比都是12h： 12h，也有16h： 8h2、 温度大多数淡水藻都可以在20〜25C左右生长，高于30C有些蓝藻不能坚持到24小时就会死亡一般所有的 绿藻生长的温度相对比较广一些在10C左右会几乎停止生长，但是不会死亡非水华类的蓝藻更加可以 耐低温的环境，低于10C还可以生存但是水华类的蓝藻对温度要求更加精确一些，过高或者过低的温度 都会死亡，即使留下待萌发的孢子，但是在实验室不具有底泥萌发的条件，藻种是不会再萌发出来的 我库的大部分藻种，没有特别说明，其培养温度都是20〜25C3、 特殊藻种培养要求衣藻如果在营养丰富的培养基中生长，都会有变成类似四集藻型的趋势所以建议培养的时候稀释一下SE 培养基，或者用土水培养基来保持它的形态结构团藻属的藻类需要勤接种，使用营养太丰富的培养基，它可能会由群体散开成为单个游动的细胞 培养含有叶绿素的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一粒豌豆；无色的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一两 粒谷粒或者小麦。

硅藻可以使用很多种培养基来培养，但是培养基中必须含有硅，建议硅藻的培养基中 Na2SiO3 . 9H2O 达到 10－30mg/l藻种的采集、分离技术浮游藻类定性样品可以用浮游生物网 25#网采集，在自然水体中采集藻类的时候，如果为了分离和检 验藻类生活水体的相关指标，通常还需要采集自然水体作分析用浮游藻类定量样品用采水器采集1升水， 装瓶加入5〜10ml鲁哥氏液固定，并贴上标签，并需要记录水体pH值，气温和水温，地点和日期 附着生长的藻类和丝状藻类可以从碎石，碎叶或者其它一些可能供藻类着附生长的植物上刮下采集，装瓶 采集到的活体样品，应在短期内观察，分离；很多种类，尤其是鞭毛类的藻会在很短的时间内死亡要确定所培养的藻种是一个纯的品系，必须从样品中分离出单克隆一个纯的藻的单克隆必须是由一个单 细胞繁殖而来丝状藻的纯品系，必须来自一根丝体上的几个连续的细胞介绍几种分离的技术：1． 毛细管清洗技术选择直径为3〜4mm的软玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在 酒精喷灯的外焰上，直到玻璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管由于拉的时候的力度和掌握时 机的不同，毛细管的口径会有不同，所以经常练习，达到熟练，可以将毛细管拉成自己需要的口径，即刚 刚适合要挑取的藻细胞进入的大小。

然后用镊子把毛细管头端夹断，注意夹断的时候的用力均匀，尽量要 保证毛细管口平滑，避免成为锯齿状边缘在管的另一段加上胶吸头或者软的橡皮管用滴管吸取少量采集样品滴在灭菌后的点滴板上的凹陷上，置于解剖镜下观察如果样品中藻细胞浓度很 大，种类繁多，可以将样品用蒸馏水或者培养基稀释然后在至少6〜12个凹陷上滴入蒸馏水和培养基在解剖镜下观察，移动毛细管的细管头在需要挑取的细胞上，小心进入液体中，迅速挑取，将细胞排放在 另一个装有蒸馏水或者培养基的凹陷里用以上方法挑取12〜15个单细胞，然后在装有蒸馏水或者培养基 的凹陷中清洗 6〜12 次，每清洗一次，必须重新拉一次毛细管经过有效的清洗，将最后得到的单细胞放在 8 个装满培养基的灭菌过的小试管中，放在适合被挑取藻生长 的光照条件和温度条件下，开始培养，3〜6周后即可以镜检看是否生长了用毛细管分离的方法分离丝状藻类，按照以上所述的方法拉一根毛细管，前端带上一小钩，小心勾住藻样 中的一根单丝体，分离出来，在点滴板的凹陷清洗 6〜12次清洗结束后，取一含0.5％〜0.75％低浓度 的 agar 平板，将清洗后的藻丝体在平板上拖动几次，除去丝体表面的一些体表寄生菌。

2． 喷雾技术1964年，Wiedemanl.建立了一种相对简单的技术，既可以分离，也可以用。