Mcl-1对内质网应激介导的胃腺癌细胞凋亡敏感性的影响.pdf

安徽医科大学硕士学位论文Mcl-1对内质网应激介导的胃腺癌细胞凋亡敏感性的影响姓名：吴亚欧申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：张林杰;张旭东20100501安徽医科大学硕士学位论文 3Mcl-1 对内质网应激介导的胃腺癌细胞凋亡对内质网应激介导的胃腺癌细胞凋亡 敏感性的影响敏感性的影响 摘 要 摘 要 背景及目的：目前晚期胃腺癌的治疗仍未令人满意 一般认为这种情况在很大程度上是由于胃腺癌细胞对临床治疗药物诱导凋亡的抵抗近期的研究结果已经表明：除了线粒体外，内质网也在调节化疗药物诱发的细胞凋亡中起着重要的作用这些化疗药物能够引发内质网应激和后续未折叠蛋白反应的激活尽管未折叠蛋白反应可通过减缓内质网应激状态而保护细胞，过强或持续时间过长的应激反应可引起以凋亡为主的细胞死亡内质网应激诱导的胃腺癌细胞凋亡的调控机制尚未确定，但已经清楚很多在其它凋亡途径中有重要作用的分子也参与调节内质网应激诱导的细胞凋亡其中，Bcl-2 家族蛋白尤为重要，因为内质网应激诱导的细胞凋亡可以被过表达的 Bcl-2 或其同源性抗凋亡分子所抑制据此，本课题组旨在研究 Bcl-2 家族成员， 特别是抗凋亡分子 Mcl-1 在调控内质网应激诱导的胃腺癌细胞凋亡中的作用，以期寻找克服胃腺癌对化疗诱导凋亡不敏感的潜在靶点。

方法：方法：采用诱导内质网应激的天然核苷抗生素衣霉素在不同时间段处理胃腺癌细胞株SGC-7901和BGC-823 通过PI染色法流式细胞术检测凋亡率 Western blot 检测 caspase-8， -9， -3 的活化 Western blot 检测 Bcl-2 家族蛋白， 包括 Bcl-2， Bcl-XL和 Mcl-1 的表达 JC-1 染色、 流式细胞仪检测线粒体膜电位 （∆ψm） 的变化 qRT-PCR检测 Mcl-1 mRNA 表达pcDNA3.0/Mcl-1 质粒转染及 siRNA 技术“沉默” Mcl-1基因的表达，Western blot 分别检测 Mcl-1 转染效率 结果：结果：虽然 PI 染色检测结果，caspase -8，-9，-3 的活化以及膜电位的降低都表明衣霉素诱导 BGC-823 有一定程度的凋亡，而 SGC-7901 似乎对衣霉素诱导的凋亡稍不敏感这可能与衣霉素刺激后的 Mcl-1 分子表达的显著上升有关， Mcl-1 分子的 siRNA 敲除实验促凋亡及 Mcl-1 过表达的抗凋亡结果都表明 Mcl-1 在保护细安徽医科大学硕士学位论文 4胞抗衣霉素诱导的细胞凋亡中起着重要的作用。

相反， 衣霉素的处理不会引发 Bcl-2 和 Bcl-XL表达的显著改变 衣霉素作用 SGC-7901 细胞 Mcl-1 分子的上调和 Mcl-1在 mRNA 水平的升高有关，表明其中还可能涉及到它的转录机制 结论：结论：体外培养的人胃腺癌细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡敏感性的变化和内质网应激状况下 Mcl-1 的表达水平相关 胃腺癌细胞在内质网应激下 Mcl-1 表达水平的升高能够阻碍其诱导的细胞凋亡因此，在胃腺癌的药物治疗能引起内质网应激的情况下，Mcl-1 的靶点治疗显得尤为重要 关键词：关键词：胃腺癌 衣霉素 细胞凋亡 内质网应激 Mcl-1 安徽医科大学硕士学位论文 5Mcl-1-Mediatd Regulation of Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis of Gastric Adenocarcinoma Cells Abstract Background negative SMARTpool(Dharmacon,Lafayette,CO) 的 序 列 由Immunology and Oncology Unit, Newcastle Misericordiae Hospital, Newcastle, New South Wales, Australia 惠赠。

将对数生长期的 SGC-7901 胃腺癌细胞接种于 6 孔及 24 孔细胞培养板中，接种时分别调整细胞密度为 4×105和 1×105/孔，用含 10%小牛血清无抗生素的 HyQ DMEM(海克隆生物化学制品北京有限公司)培养液培养，37℃，饱和湿度下培养过夜，待细胞贴壁转染前需用无血清无抗生素的 HyQ DMEM 培养液稀释特异性Mcl-1 siRNA 、negative siRNA 及脂质体 2000（LipofectamineTM 2000）, 使 Mcl-1 siRNA 、negative siRNA 和脂质体 2000 的最终浓度分别为 100nm/L 和 120ml/L两者在室温混匀静置， 期间把培养板中的培养液换成含 5%小牛血清无抗生素 HyQ培养液， 20min 后再把稀释好的 Mcl-1 siRNA 和 negative siRNA 加入相应的实验孔中，转染 6h 换成含 10%小牛血清 HyQ DMEM 继续培养24 h 后加 3 µmol/L 衣霉素处理，待药物作用后收集各孔细胞，上流式细胞仪检测每组实验重复 3 次资料用 WinMDI2.9 软件分析 4.6.2 pcDNA3.0/Mcl-1质粒及空载体转染4.6.2 pcDNA3.0/Mcl-1质粒及空载体转染 对数生长期的胃腺癌细胞BGC-823调整细胞密度为4×105和1×105分别接种于6、24孔板。

用含10％小牛血清无抗生素HyQDMEM培养24 h 转染前弃原液换成无血清HyQDMEM， 设空白及阴性对照组将pcDNA3.0/Mcl-1质粒及空载体(由中科大生命科学院吴缅实验室惠赠)， 按照脂质体LipofectamineTM2000说明书的操作步骤， 将pcDNA3.0/Mcl-1质粒及空载体分别与脂质体混合后在24孔板中转染细胞，24 h后加3 µmol/L衣霉素处理Western blot安徽医科大学硕士学位论文 27鉴定Mcl-1转染效率及PI单染流式细胞凋亡率每组实验重复3次资料用WinMDI2.9软件分析 4.7 统计学分析 4.7 统计学分析 数据的录入和分析采用 SPSS 10．0 统计软件数据以x±s 表示，组间比较采用方差分析两组间均数比较使用 t 检验使用趋势性χ2检验分析衣霉素诱导胃腺癌细胞株 SGC-7901 及 BGC-823 凋亡呈剂量和时间相关性 安徽医科大学硕士学位论文 285 结果 5.1 胃腺癌细胞株SGC-7901较BGC-823对衣霉素诱导的凋亡更不敏感 5.1.1 衣霉素5 结果 5.1 胃腺癌细胞株SGC-7901较BGC-823对衣霉素诱导的凋亡更不敏感 5.1.1 衣霉素诱导诱导胃腺癌细胞株胃腺癌细胞株发生内质网应激反应发生内质网应激反应 78kDa糖调节蛋白(Glucose Regulated Protein 78kDa， GRP78)是内质网中最重要的分子伴侣之一，作为一种应激反应蛋白GRP78是内质网应激的标志性分子之一，衣霉素诱导后表达明显上调 (图1A) ，证实内质网应激的发生。

5.1.2 胃腺癌细胞株SGC-7901较BGC-823对衣霉素诱导的凋亡更不敏感 5.1.2 胃腺癌细胞株SGC-7901较BGC-823对衣霉素诱导的凋亡更不敏感 PI单染法检测细胞凋亡率发现衣霉素诱导胃腺癌细胞株SGC-7901及BGC-823凋亡具有剂量和时间相关性 (图1B、1C))随着衣霉素剂量的增加胃腺癌细胞株SGC-7901及BGC-823凋亡率呈上升趋势， 据本课题组前期实验结果选择3µmol/L衣霉素作用于两株细胞，随着时间的延长相同浓度细胞凋亡率亦呈现上升趋势（趋势性χ2检验P值均<0.05），两株细胞中BGC-823较SGC-7901对衣霉素稍敏感 A B 02468101201.5369SGC BGC0h 12h 24h 36h 0h 12h 24h 36hBGC-823SGC-7901 78kD GRP78β-actin凋亡率（％） 剂量（µmol/L）安徽医科大学硕士学位论文 29C 图 1 胃腺癌细胞株 SGC-7901 较 BGC-823 对衣霉素诱导的凋亡更不敏感 A. 未折叠蛋白反应在胃腺癌细胞中可被衣霉素激活 B.不同浓度衣霉素诱导 BGC-823/ SGC-7901 36h 的凋亡率变化曲线。

图中所示细胞凋亡率为三组 实验的平均值 C. 3µmol/L 衣霉素不同时点诱导的胃腺癌细胞凋亡率 图中所示细胞凋亡率为三组实验的平均值Fig 1 The gastric adenocarcinoma cell lines are relatively resistant to ER stress-induced apoptosis. B. TM-induced apoptosis of BGC-823/ SGC-7901 at different doses for 36h. The data shown are the mean of three individual experiments. C. The apoptotic rates of BGC-823/ SGC-7901 cell lines induced by 3µmol/L TM The data shown are the mean of three individual experiments. 5.2 线粒体途径在衣霉素衣霉素诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥重要作用 由于内质网应激反应性凋亡通路与死亡受体介导的“外源性”凋亡途径及线粒体介导的“内源性”凋亡途径间是相互关联和互相影响的。

于是我们考虑胃腺癌细胞对内质网应激性凋亡相对不敏感可能是由于这两条通路中某些分子在发挥作用，为了寻找原因下面对“外源性”凋亡途径和“内源性”凋亡途径都进行了检测 首先，Western blot 检测衣霉素处理前后 Pro-caspase-8，-9，-3 的活化发现，衣霉素能有效地诱导 Pro-caspase-9,-3 活化，随着作用时间延长，Pro-caspase-9，-3 的表达逐渐减少， 在 BGC-823 中活化表现更明显， 此结果也与前述的 BGC-823 较 SGC-7901细胞对衣霉素较敏感保持一致；然而作为“外源性”凋亡途径起始活化分子的012345678910036122436 小时(h)凋亡率（％） SGC BGC安徽医科大学硕士学位论文 30Pro-caspase-8 活化较 Pro-caspase-9,-3 却不显著（图 2） ，这提示“内源性”凋亡途径可能在衣霉素诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥更重要的作用 线粒体介导的“内源性”凋亡途径是由于线粒体膜电位改变所致JC-1 是一种绿色荧光分子，对线粒体膜具有通透性的亲脂性阳离子染料，广泛用于检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位（Ψm△）的理想荧光探针。

粒体膜电位较高时，JC-1 聚集粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光，表现为细胞集中于右上象限；粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集粒体的基质中，此时 JC- 1 为单体，可以产生绿色荧光，表现为右上象限的细胞下移至右下象限通过 JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降 衣霉素作用于胃腺癌细胞后，线粒体膜电位发生变化，膜电位明显减少，即红色荧光减少，绿色荧光增加，右上象限的细胞明显下移至右下象限（图 3） 衣霉素诱导的线粒体膜电位减少，表明了衣霉素诱导的凋亡可能极大程度的依赖于线粒体凋亡途径而且，BGC-823 线粒体膜电位下降较 SGC-7901 明显此结果也与前述的 BGC-823 较 SGC-7901 对衣霉素较敏感保持一致 图 2 Western blot 检测衣霉素诱导的胃腺癌细胞凋亡中 caspase-8，-9，。