基因研究方法课件.ppt
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分子细胞生物学研究方法分子细胞生物学研究方法(一一)功能基因的筛选方法功能基因的筛选方法基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法:1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究基因研究方法课件 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选一、文献查阅一、文献查阅基因研究方法课件 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选一、文献查阅一、文献查阅二、充分利用二、充分利用GeneBank、、SymAtlas(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/)、、ZFIN等网上公共资源等网上公共资源a. 直接查阅基因表达信息直接查阅基因表达信息基因研究方法课件 Mouse jumonjiHuman RAN binding protein 1基因研究方法课件 NCI_CGAP_Zkid1: adult kidneyNIH_ZGC_8: LiverNIH_ZGC_26: ovary, 1 year old femaleNIH_ZGC_21: skin, normal adultNIH_ZGC_6: testisNIH_ZGC_27: whole body, 30dpfNIH_ZGC_29: 30dpf, whole body, probable malesSgano SJD adult male: whole body, adult maleNIH_ZGC_28: whole body, female 基因研究方法课件 De Ruijter AJ et al. 2003. Biochem. J. 370: 737-749. (review)HDAC expression in various normal and cancerous cells基因研究方法课件 E11.5E14.5HDAC2 highly expresses in heart region during embryonic developmentE12.5 15.5 17.5 P 3 15 25 65-HDAC2-tubulinHDAC2 expression levels in heart Yin Z et al. (2007). Nat. Med. 13, 324-331.基因研究方法课件 对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选筛选一、文献查阅一、文献查阅二、充分利用二、充分利用GeneBank、、SymAtlas(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/)、、ZFIN等网上公共资源等网上公共资源a. 直接查阅基因表达信息直接查阅基因表达信息b. 对大量的对大量的est资源进行利用和分析资源进行利用和分析:如熟知斑马鱼的一些被大量阅码的常用如熟知斑马鱼的一些被大量阅码的常用cDNA文库：文库：NIH_ZGC_4: brainNIH_ZGC_15: embryo, 2-8hpfNIH_ZGC_18: embryo, 18-20hpfNCI_CGAP_Zemb2: embryo, 24hpfGISZF001: embryo, 0-72hpfNCI_CGAP_Zemb3: embryo, 72hpfZebrafish adult retina cDNA: adult eye, retina 1-2 year oldNIH_ZGC_9: eye, 72hpfNIH_ZGC_22: GillNIH_ZGC_17: adult heart基因研究方法课件 鱼类研究的遗传资源鱼类研究的遗传资源Cossins A and Crawford DL. 2005. Nat. Rev. in Genetics, 6, 324-333.基因研究方法课件 一、文献查阅一、文献查阅二、充分利用网上公共资源二、充分利用网上公共资源三、对组织细胞特定过程中差异表达基因的筛选三、对组织细胞特定过程中差异表达基因的筛选对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选筛选基因研究方法课件 Mehta D. et al., 2010. Curr. Psychiatry Rep. 12, 135-144.基因表达的研究方法基因表达的研究方法基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 Yin Z, Kwang J & Sin YM.Carp interleukin-1 beta in the role of an immuno-adjuvant FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY 10 (4): 375-378 MAY 2000 Con A treatmentcontrolDriver cDNATest cDNAcDNA subtraction cloningInduced cDNA List:Interleukin-1Janus kinase-2Transforming growth factor-ß1Heat shock protein 70Heat shock protein 90Elongation factor-1ßBleomycin hydrolaseCytochrome c oxidase subunit IICytochrome C oxidase subunit IIINovel estsPercoll基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Using DNA microarrays to monitor the expression of thousands of genes simultaneously 基因研究方法课件 Using cluster analysis to identify sets of genes that are coordinately regulated 基因研究方法课件 HDAC2 transcripts were 45 fold down regulated in 2 sets of HDAC2-/- ventricle samplesWT1WT2null2null1基因研究方法课件 TABLE 2. Comparison of some gene expression levels in HDAC2 null heart with microarray analysisGeneFold difference of expression compared with WT Cell cycle, proliferation, meiosis, coenzyme metabolismCell division cycle 20 homolog3.7Stromal antigen7.6Rec8-like 17.4SMC-like 14.8Polymerase, epsilon 2 (p59 subunit)8.1Cyclin C9.2Telomerase reverse transcriptase9.5Cell division cycle 37 homolog5.6Muscle development, contractionTroponin T3-26.3Myosin light chain-24.3ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, fast twitch 1-7..8Myosin, heavy polypeptide 6, cardiac muscle, alpha-6.5Tropomyosin 2, beta-6.3myogenin-7.6Actinin alpha 3-.7.2myozenin-3.2基因研究方法课件 Identified Pathway (DAVIS): NFAT and Hypertrophy of the heart (Transcription in the broken heart)(Mus musculus) suppressed in HDAC2 nullMyocyte enhancer factor 2C (MEF2c)Gata binding protein 4 (Gata 4)Thymoma viral proto-oncogene 1 (Akt)Calmodulin 1Alpha-actin, skeleton muscle (-actin)基因研究方法课件 Cossins A and Crawford DL. 2005. Nat. Rev. in Genetics, 6, 324-333.基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法:1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究Double muscle cattleMyostatin mutantSplotch mice基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的产生基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的产生1。
物理诱变物理诱变 （如放射线、紫外线照射）（如放射线、紫外线照射）2化学诱变剂化学诱变剂 （如（如ENU，， N-ethyl-N-nitrosourea)基因研究方法课件 基因研究方法课件 Generation of mutants with developmental defects in zebrafish by ENU mutagenesisPeng J. et al. (2004). Chinese Sci. Bullet. 49: 2154-2158.3.0 mM ENUTreatment35 muatnt lines/320F2 families基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 基因研究方法课件 对基因突变的个体的获取及分析对基因突变的个体的获取及分析一、对自然突变的观察、收集和研究一、对自然突变的观察、收集和研究二、基因诱变导致突变品种的产生二、基因诱变导致突变品种的产生1物理诱变物理诱变 （如放射线、紫外线照射）（如放射线、紫外线照射）2化学诱变剂化学诱变剂 （如（如ENU，， N-ethyl-N-nitrosourea)3.DNA插入插入 a. DNA片段插入片段插入 b. 病毒插入病毒插入 c. 转座子插入转座子插入基因研究方法课件 Gene trapping b bgeo reporterSAATGpAInsertional mutationsAccessible to molecular analysisTag gene for expression analysisEfficient: single transfection gives 100s of mutationsBut, random insertions lack precision & intronic location 基因研究方法课件 Identification of trapped genes by 5’ RACEAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAExon 1ß geo trapRNAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAß geo primer 1Prime cDNA with Reverse Transcriptase5’3’Enzymatically add tag sequence to cDNA 3’ endcDNA5’3’3’PCR amplify with primers to tag sequence and ßgeoClone and sequence to identify Gene XGene Xß geo primer 2基因研究方法课件 Whole Genome Mutagenesis: Advantages of gene traps:1)Pre-existing commercial collections2)Trap often creates hypomorphic or null allele3)Can use RT-PCR to screen for gene disruption4) ß-Geo servers as histological or enzymatic assay of target gene expression基因研究方法课件 International Gene Trap ConsortiumResourceTags in dbGSSEnsembl genesGenome coverageBG9,7753,19421%SIGTR7,3542,33016%GGTC9,8282,15915%ESDB5,5009887%FHCRC1,6277174%CMHD4,0235923%Total38,1075,72436%http://www.igtc.org.ukMutations available for 36% of genes基因研究方法课件 Tol2Tol2转座子介导的基因增效基因诱捕技术转座子介导的基因增效基因诱捕技术Kawakami K. 2005. Dev. Dyn. 234: 244-254.Parinov S. et al. 2004. Dev. Dyn. 231: 449-459.基因研究方法课件 建立建立Tol2转座子增效基因诱捕的转基因斑马鱼诱变品系库转座子增效基因诱捕的转基因斑马鱼诱变品系库 突变品系的筛选工作：突变品系的筛选工作：已注射近已注射近400400粒斑马鱼受精卵，目前筛选成功率为粒斑马鱼受精卵，目前筛选成功率为2/20,2/20, 尚有近尚有近200200尾有待筛选检查尾有待筛选检查F030hpfF15dpf基因研究方法课件 Screening for temperature-sensitive bacterial or yeast mutants 基因研究方法课件 Screens can detect mutations that affect an animal's behavior 基因研究方法课件 特异性功能基因的筛选和寻找方法特异性功能基因的筛选和寻找方法:1）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选）对表达于特定组织、特定阶段的功能基因的筛选2）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选）对在特定的生理过程中表达的的功能基因的筛选3）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位）自然突变及基因诱变的表现型筛选观察与其基因定位4）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究）同已知的具有特定功能的基因的相关基因的筛选和研究基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基因表达的抑制）因表达的抑制）f.相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找g.与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究）h.改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）基因研究方法课件 Results of a BLAST searchSequence similarity can be provide clues about protein function基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）基因研究方法课件 Domain information for zebrafish gaspProtease inhibitor domainDEAD domain: RNA bindingKRXXKRKR etc: nuclear localizatin signalZinc finger domain: DNA bindingHomeodomain: DNA binding : Secretary signal peptide analysis……Many domain analysis software on the web!!!基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization) 1。
细胞、组织染色（细胞、组织染色（Ab免疫染色）免疫染色） 2融合蛋白技术部（应用于蛋白定位、蛋白纯化提取）融合蛋白技术部（应用于蛋白定位、蛋白纯化提取）基因研究方法课件 Fusion proteins can be used to analyze protein function and to track proteins in living cells (1)Epitope tagging allows the localization or purification of proteins基因研究方法课件 Fusion proteins can be used to analyze protein function and to track proteins in living cells (2)Fluorescence resonance energy transfer (FRET). 基因研究方法课件 Three types of matrices used for chromatography 基因研究方法课件 Purification of protein complexes using a GST-tagged fusion protein 基因研究方法课件 Popular Epitope tagging for fusion protein studies:GST (glutathione S-transferase, 25kDa)FLAG (“DYKDDDDK”, synthesized)HIS (“HHHHHH”, synthesized)C-MYC (“EQKLISEEDL”, part of c-myc, synthesized)HA (“YPYDVPDYA”, part of hemagglatin, synthesized)VSV-G (“YTDIEMNRLGK”, synthesized)HSV(“QPELAPEDPED”, synthesized)V5 (“GKPIPNPLLGLDST”, synthesized)GFP ( about 235aa, 47kDa)基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验））基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验）蛋白结合功能区蛋白调控功能区pSV40，，or pCMV, or other specific promoter 蛋白结合功能区突变的蛋白调控功能区pSV40，，or pCMV, or other specific promoter Dominant negative formWild-type form基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验））基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验） 2）特定外界刺激反应条件）特定外界刺激反应条件 （激素或细胞因子、营养条件、分化状况、（激素或细胞因子、营养条件、分化状况、物理化学刺激等）物理化学刺激等）基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基基因表达产物的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性、基因表达的抑制因表达的抑制) 1）基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验））基因过量表达（强启动子调控野生型或突变型蛋白的细胞转染实验） 2）特定外界刺激反应条件）特定外界刺激反应条件 （激素或细胞因子、营养条件、分化状况、（激素或细胞因子、营养条件、分化状况、物理化学刺激等）物理化学刺激等） 3）基因的）基因的mRNA的降解破坏的降解破坏基因研究方法课件 RNAi IntroductionRNAi = RNA interferenceThe term used to describe the interference of RNA as a natural mechanism, and also as a scientific research tool.The silencing of gene expression by double-stranded RNA molecules.基因研究方法课件 RNAi IntroductionNaturally RNAi acts as a gene defence mechanism. It’s purpose is to silence types of RNA that are not normally produced by cells such as RNA viruses and rogue genetic elements.RNAi is a useful tool to find out the function of a gene. 基因研究方法课件 RNAi IntroductionEarly days of molecular biology: Forward GeneticsAnalysis that starts with phenotype to determine the genotype. Trait Identification DNA Sequencing Mutation Identification Gene FunctionModern times: Reverse GeneticsControlled manipulation of genes to determine phenotype. DNA Sequencing Gene manipulation Gene Function(siRNA)基因研究方法课件 siRNA IntroductionsiRNA are short dsRNA molecules- 21 nucleotide strands of RNA in a staggered duplex- 19 nucleotides double-stranded, with 2 base overhangs.基因研究方法课件 siRNA is created when an enzyme known as Dicer cleaves dsRNA into the short duplexed structure known as siRNA.siRNA Introduction基因研究方法课件 siRNA Introduction基因研究方法课件 Mechanism for RNAi to knock down RNA product基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）f.相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找g.与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究）h.改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察基因研究方法课件 From Current ProtocolsCo-Immuno-precipitation (Co-IP)基因研究方法课件 From Current ProtocolsGST pulldown基因研究方法课件 Cellular localization of the C114 protein (1)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Cellular localization of the C114 protein (2)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Nucleotide binding analysis of the C114 proteinYin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (1)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (2)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 C114 interacts with PKR (3)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits PKR activation (1)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits PKR activation (2)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 Association of C114 and PKR inhibits PKR activation (3)Yin Z., et al. (2003). JBC. 278: 22838-22845.基因研究方法课件 IgGbeadsProtein ofinterestCBPProtATEVsiteBoundproteinsWash outcontaminantsTEVproteaseCalmodulinbeadsEGTATandem Affinity Purification (TAP)After Rigaut et al. (1999) Nature Biotech. 17: 1030基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）f.相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找g.与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究）h.改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察基因研究方法课件 基因功能的体外和体内分析方法一、体外方法：一、体外方法：a.文献查阅文献查阅b.基因序列分析基因序列分析-1（同源基因的寻找和功能比较）（同源基因的寻找和功能比较）c.基因序列分析基因序列分析-2 （（ 利用生物信息学分析可能的功能基团）利用生物信息学分析可能的功能基团）d.基因编码蛋白的细胞内定位基因编码蛋白的细胞内定位 （胞内转位现象，（胞内转位现象，trans-localization)e.基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）基因表达方式的改变（组织细胞分布、时序特征、受刺激表达特性）f.相互作用蛋白的寻找相互作用蛋白的寻找g.与核苷酸结合的活性与核苷酸结合的活性(蛋白质对启动子调控的研究）蛋白质对启动子调控的研究）h.改变表达特性导致的细胞表现型观察改变表达特性导致的细胞表现型观察基因研究方法课件 The modular structure of a gene activator protein 基因研究方法课件 The yeast two-hybrid system for detecting protein-protein interactions 基因研究方法课件 Invitrogen基因研究方法课件 InvitrogenTwo-hybrid prey vectorB42 = transcription activation domain基因研究方法课件 DUALmembrane 2-hybrid system (DUALsystems)BaitPreySplit-ubiquitin基因研究方法课件 A map of the protein protein interactions observed between different functional groups of proteins in the yeast S. cerevisiae 基因研究方法课件 。
