绿色荧光蛋白(gfp)标记亚细胞定位.doc

绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位标记亚细胞定位一、原理一、原理利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术利用 GFP 融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，在光镜水平进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响并且 GFP 的分子量为 27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究二、主要步骤二、主要步骤1．．真核表达载体真核表达载体的构建的构建①引物设计利用引物设计软件，根据 pEGFP-N1 的酶切位点设计目的基因引物： ②载体构建将 PCR 产物酶切后插入 pEGFP-N1，得到表达目的基因与 EGFP 融合蛋白质的真核表达载体2．转染真核细胞．转染真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。

当细胞贴壁率达到 30%~50%时，将表达载体质粒 2ug 和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml 分别溶于 100 ml 无抗生素、无血清的 DMEM 培养基中，充分混匀后，室温放置 15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置 30 min同时用无血清、无抗生素的 DMEM 洗涤待转染的培养细胞 2~3 次，向 DNA-脂质体混合物中加入800 ml 无抗生素、无血清的 DMEM 培养基，混合后加入到培养细胞中培养皿放入 37℃孵箱孵育 6~8 hr 后吸去双无培养液，加入 2~3 ml 含抗生素和 10% FCS 的 DMEM 完全培养基，继续培养 24~72 hr4．激光扫描共聚焦显微镜观察．激光扫描共聚焦显微镜观察将上述细胞分别在 24、、36、48、72 小时用共焦显微镜观察，采用激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为 488nm，采取图像。