线粒体疾病的分子生物学检验课件.ppt

线粒体疾病的分子生物学检验Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders1线粒体（Mitochondrion）1. 1. 真核细胞真核细胞中的细胞器，中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命，平均寿命1010天天2. 2. 多数细胞多数细胞含含几个到几个到几千个线粒体几千个线粒体3. 3. 每个线粒体含每个线粒体含2-10 2-10 线粒体线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA）2线粒体功能Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648 ATP能量代谢能量代谢3其他功能其他功能 储存钙离子储存钙离子 调节膜电位并控制细胞程序性死亡调节膜电位并控制细胞程序性死亡 细胞增殖与细胞代谢的调控细胞增殖与细胞代谢的调控 合成胆固醇及某些合成胆固醇及某些血红素血红素 产热产热 Wikipedia4线粒体病线粒体病 Mitochondrial disordersMitochondrial disorders发发现现- 1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。

直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突变可引起人类疾病 定定义义- - 是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病发病率发病率- - 约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink 20065线粒体病线粒体病 mitochondrial disordersmitochondrial disorders 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569 bp circular double stranded (mtDNA) 20%1,500 nuclear genes 80% structural protein of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fissionDouglas C. Wallace, 18171819Shoubridge, 2001; Schapira，20006进一步导致线粒体功能异常：底物的运输缺陷；底物的利用缺陷；柠檬酸循环异常；氧化磷酸化脱偶联；呼吸链异常。

7发病特点发病特点v 核基因突变常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传 v 线粒体基因突变母系遗传 （突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导遗传异质性婴幼儿起病较常见8 编码线粒体结构蛋白的核基因突变编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征 线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡核基因突变9线粒体基因突变 突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常 阈值效应：组织特异性 突变的 mtDNA 在复制分离时可能不均等分配 母系遗传：不同突变后代发病风险不同 相比A8344G突变，携带 A3243G 突变的母系后代更容易发病 突变分布：同质性各器官组织分布相同 异质性不同组织、细胞分布不同 一般特点10母系遗传 （Maternal Inheritance）1111同质性突变与异质性突变12线粒体基因线粒体基因q同质性（同质性（Homoplasmy）q0或或100%q异质性（异质性（Heteroplasmy）q0-100%核基因核基因q纯合子（纯合子（Homozygous）q0或或100%q杂合子（杂合子（Heterozygous）q50%12mtDNA同质性/异质性突变与阈值1313线粒体基因突变点突变点突变 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种 LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排重排 重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等 (http：/www.mitomap.org)14线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂遗传方式复杂q常染色体隐性遗传（常染色体隐性遗传（Autosomal RecessiveAutosomal Recessive）q常染色体显性遗传（常染色体显性遗传（Autosomal DominantAutosomal Dominant）q性连锁遗传（性连锁遗传（Sex linkedSex linked）q母系遗传（母系遗传（Maternally inheritedMaternally inherited）临床表型复杂临床表型复杂q累及多系统（累及多系统（Multisystemic involvementMultisystemic involvement）q影响几乎所有组织器官（影响几乎所有组织器官（Any organ or Any organ or tissue can be affectedtissue can be affected） 1515线粒体功能涉及众多的组织器官16线粒体病的共同临床特点l 婴儿期发病： 常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。

l 儿童发病： 见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSSl 中枢神经系统损害： 共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等l 周围神经损害： 交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征l 视听神经损害： 视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSSl 肌肉病 见于线粒体肌病、MELAS和KSS眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinnery et al. Lancet 200017线粒体疾病的生化诊断线粒体疾病的生化诊断当患者基因当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断代谢产物分析代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；，（动脉比静脉好）；乳酸乳酸/丙酮酸比高丙酮酸比高(50:1)提示呼吸链受到阻断提示呼吸链受到阻断正常不除外线粒正常不除外线粒体疾病体疾病酶测定酶测定氧化磷酸化（氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定）系统的酶活性测定western、比色法等）比色法等）方法不稳定方法不稳定一般情况下，一般情况下，血清血清CK（肌酸激酶）（肌酸激酶）正常或轻度升高正常或轻度升高；升高升高占占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失丢失时时非常高非常高。

J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-29218线粒体疾病的生化诊断线粒体疾病的生化诊断当患者基因当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断肌肉活检肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或细胞色素阴性肌纤维或破碎红破碎红纤维（纤维（RRF）为主要病理改变为主要病理改变2）上述病理改变出现的频率高上述病理改变出现的频率高3）缺乏其他的肌肉病理改变缺乏其他的肌肉病理改变J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-29219儿童及成人线粒体疾病的诊断标准儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A A 符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系统不明原因发病多系统不明原因发病 必须至少三个系统出现临床症状必须至少三个系统出现临床症状 除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能 排除其它代谢和非代谢疾病排除其它代谢和非代谢疾病B B 肌活检肌活检在骨骼肌中存在在骨骼肌中存在2%2%破碎样破碎样红肌纤维红肌纤维主要诊断标准(Bernier et al, 2002)(3, 5)20C C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：5050岁以下肌活检岁以下肌活检COXCOX阴性肌纤维阴性肌纤维2%2%； 50 50岁以上肌活检岁以上肌活检COXCOX阴性肌纤维阴性肌纤维55% %； 任一任一组织中呼吸链组织中呼吸链酶活性酶活性20%20%； 任一细胞系中呼吸链酶活性任一细胞系中呼吸链酶活性30%30%； 多于两组织内相同呼吸链酶活性多于两组织内相同呼吸链酶活性30%30%；主要诊断标准21次要诊断标准：A症状符合线粒体脑肌病的临床表现症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：30503050岁肌活检岁肌活检RRFRRF在在1%2%1%2%；30 30 岁以下肌活检出现岁以下肌活检出现RRFRRF；电镜下见广泛线粒体异常电镜下见广泛线粒体异常；B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现至少一种呼吸链功能受抑制的表现：生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%30%20%30%；用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；(Bernier et al, 2002)(3, 5)22次要诊断标准：C发现可能相关的发现可能相关的mtDNA异常异常；D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现：一种或多种氧化磷酸化受损的表现：脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和( (或或) )丙氨酸增高；丙氨酸增高；若疑为若疑为KSSKSS，脑脊液蛋白质增高；，脑脊液蛋白质增高；PETPET或或31P-MRS31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；证实肌肉或脑代谢降低；最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。

最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低Bernier et al, 2002)(3, 5)23u 符合以上符合以上2 2个主要诊断指标或个主要诊断指标或1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及2 2个次要个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；诊断指标的即为确诊线粒体病；u 符合符合1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及1 1个次要诊断指标或至少个次要诊断指标或至少3 3个次要个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；诊断指标的为拟诊线粒体病；u 符合符合1 1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1 1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病个次要诊断指标的为疑诊线粒体病J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-29224线粒体病诊断时应注意线粒体病诊断时应注意 基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合性等相结合 要区分病。