美兰染色法检测酵母活性的优化试验.doc

美兰染色法检测酵母活性的优化试验广州珠江啤酒集团有限公司技术中心（510308）孔祥诚陈江李晓聪吴小映啤酒酵母质量的检测方法主要分为两类：一是检测酵母活性，二是检测酵母活力酵母活性是指酵母能否成活的能力，而酵母活力是衡量活细胞活动能力或发酵性能的指标当然酵母活性比酵母活力对酵母状态的判断要弱，只限于鉴别酵母的死活,不能明确地分辨活体酵母细胞的质量，但酵母活性的检测方法比酵母活力的检测相对要简单，检测时间短，在日常的生产检验中应用更强美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色文献中查找美兰染色法时，发现有多种美兰染色液的配制方法我们选择了三种差异较大配制方法进行比较试验，找出一种染色易于判断，结果准确的酵母活性检测方法还对美兰染色方法进行优化，分析操作中易引起误差，以提高检测方法的准确性1材料与方法1.1L1100系列生物显微镜1.2试剂及配制方法：方法1：FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液：溶液A：次甲基蓝蒸馏水溶液0.1g/500ml，溶液B:磷酸二氢钾蒸馏水溶液13.6g/500ml,溶液C:磷酸氢二钠（12出0）蒸馏水溶液2.4g/100ml,溶液D:498.75ML溶液B+1.25ML溶液C,溶液E:混合500ML溶液D和500ML溶液A,配制的次甲基蓝缓冲液PH为4.6。

方法2：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%次甲基蓝溶液）：次甲基蓝O.OIg,二水合柠檬酸三钠2g,用蒸馏水定容至100ml123方法3:吕氏碱性美兰染色液：次甲基蓝0.3g,95%乙醇30ml,0.01%氢氧化钾溶液100ml,将次甲基蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合1.3美兰染色法比较试验配制不同酵母状态的样品(如：扩培酵母液，发酵液，回收酵母，还可对酵母进行老化处理等)分别用三种美兰染色液对其活性检测染色液与酵母样品液等量混合，染色3-5min，用血球计数板计数，细胞总数在(30-60)K06个/ml每一种方法对同一酵母样品进行检测时，同时由三个人来计数，记录结果，注明细胞染色判断的难易通过对三个人检测结果分析，染色判断的难易来找出较优的美兰染色法，结果见(表1)表1三种美兰染色法检测酵母活性比较结果样品FINK和KULES甲基蓝方法2%二水合柠檬酸钠方法吕氏碱性美兰方法检测人1检测人2检测人3检测人1检测人2检测人3检测人1检测人2检测人3死亡率(%)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(％)判断难易死亡率(%)判断难易死亡率(％)判断难易10**2.36**0.3***1.35***3.68***3.7***0.2*0*0*21.72**0.3**2.17**2.7***1.75***3.4***0*0.3*0*32.06**2.3**4.25**6.17***4.3***6.69***0.3*0*0*46.4***5.35***8.96***7.89***8.3***11.2***1.94*0*2.4*58.54**4.9**8.49**13.4***10***11.6***2.42*3.2*5.8*65.28**4.6**9.4**7.54***5.4***5.81***1*1.8*2.3*734.8**33.8**48.8**51.3***54.1***47.9***1.5*1.8*1.2*838.4**48.7**45.6*40.5***33.1***47.5***946.7**42**64.4**50.7***58.8***66.2***1044.8**78.7**78.1**67.8***82.1***86.1***注：判断难易表示：容易：***、一般：**、困难:样品7-10经过老化处理。

1.4美兰染色法优化试验选用较优的美兰染色法，染色时间分别为：小于1min、3min、5min和20min进行计数比较试验；用血球计数板计数时，装片后立刻计数和放置15min后计数比较，结果见（表2）表2美兰染色法（2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液）优化试验结果样品不同染色时间的死亡率(%)小于1min3min5min20min立刻观察装片后15min立刻观察装片后15min立刻观察装片后15min立刻观察111.04.117.75.315.39.213.5212.55.015.915.920.0褪色难以分辨8.0323.025.020.018.322.422.420.3410.910.9------13.913.912.550.30.30.20.20.250.250.2611.711.712.312.314.614.6---710.2褪色难以分辨11.7褪色难以分辨10.2褪色难以分辨---3分析与讨论3.1美兰染色法的比较（表1）中三个人用三种配方的美兰染色液对不同状态的酵母的活性进行检测，染色判断的难易结果统计如下：方法1的判断难易分布为：容易：13.3%一般：83.3%困难：3.3%方法2的判断难易分布为：容易：100%一般：0%困难:0%方法3的判断难易分布为：容易：0%一般：0%困难:100%由此可见，方法2（2%二水合柠檬酸钠）在检测过程的染色判断较其它两种方法容易。

在检测过程中发现，方法2的染色酵母在较短的计数过程中几乎不存在染色深浅之分，色泽较均匀，在计数板上放置较长时间才有少量酵母出现褪色现象；而方法1与方法3都有染色深浅之分，色泽不均匀，其中方法3褪色较快，判断困难方法3检测经老化处理的样品7的死亡率约为1.5%，远远低于方法1与方法2结果，显然方法3的检测结果不够准确，可能是染色液对死亡酵母没能着色或褪色较快的原因表3三人检测结果的平均值和方差样品FINK和KULES甲基监方法2%二水合柠檬酸钠方法平均值方差平均值方差10.89:1.282.911.3521.40.982.620.8332.871.25.721.2646.91.869.131.857.312.0911.71.766.432.66.251.14739.18.3951.13.1844.25.2840.47.2951r11.858.67.751067.219.478.79.62（表3）对方法1和方法2的三个人的检测结果进行数据分析：当酵母死亡率较低时方法2与方法1的方差分析结果相接近；而样品（样品7-10）经过老化处理时，方法1的方差明显高于方法2,这是由于FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液对大量死亡细胞染色时染色深浅不一，色泽不均匀，影响了每个人的检测结果。

此外，经过老化处理样品的检测结果方差高，是由于老化处理后酵母出现许多形态异常的个体，每个人对形态异常酵母计数尺度不同，造成检测结果有较大差异虽然方法1和方法2对酵母的活性的检测效果是相近的，但从判断染色难易的角度，我们认为方法2是三种美兰染色法是较优的，酵母染色深浅一致使检测人对染色判断较为容易，判断更加准确，在日常酵母活性检测中较为适用但还发现了方法2的检测结果要高于方法1的，这可以通过其它酵母的活力检测方法对其校验，使该美兰染色法的检测结果反映真实酵母状态3.2美兰染色法优化在不同配方的美兰染色法比较试验中，选出2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液为较优方法，并归纳各人对染色法操作意见，引起结果误差的原因，进一步对美兰染色法优化在试验过程中初步得出染色时间在3-5min比较合适，因为染色时间（小于1min）太短酵母与染色剂的相互作用没有完成，对同一样品反复多次试验，在较短染色时间条件下检测死亡率数据波动大；而同一样品染色5min左右后检测的死亡率在一定范围内比较稳定，重复性较好，且染色较深易于判断，与文献报道相符表2的检测结果表明：用血球计数板计数时，装片后染色酵母随时间的延长，少量细胞会有褪色现象，这是由于少量衰弱没死亡的酵母经过相对较长时间还原次甲基蓝为无色。

酵母活性检测细胞计数应在较短的时间（5min）内完成，避免褪色影响检测结果4总结美兰染色法检测酵母活性的操作注意以下几点：1）检测的样品应有较强的代表性特别是回收酵母，取样时须排掉取样口管道内样品，样品稀释须摇匀，样品与染色液混合均匀等2）由于试验中装片后染色的酵母细胞会有少量褪色，影响结果在血球计数板计数时先数染色细胞，再计细胞总数，计数时间在5min内为宜平行样品计数需重新装片，避免放置时间过长染色细胞褪色3）细胞总数和染色细胞的计数判定如（表4）表4细胞总数和染色细胞的计数判定鈿曲总数计数（个〕染色细胞计数⑴1计数件）染色细胞计数er〕0正第I0*正常（子细胞小于母体细腥大小】吃）11•正第111正第〔子跚腮大于或等于母体细胸大小1/2）22正常〔子細胞小于母祥细胞大如⑵109正常〔子鈿粕大于或等于母体细腥犬小1圧）214）回收酵母检测时，极少数形态异常的酵母细胞（约正常细胞大小的1/2或更小，轮廓不圆滑，细胞拉长变形等特征）常常被染色，由于形态异常给检测人计数造成一定困难，但对检测结果影响不大当形态异常的酵母细胞过多时，不同检测人的检测结果会有较大差异，造成结果不准确从另一方面看，异常酵母多少也恰恰反映了酵母质量的好坏，可根据异常酵母细胞占的比例判断酵母质量。

啤酒酵母质量检查是啤酒生产过程中一项重要的日常工作，美兰染色法对酵母活性检测方便简单，但操作的不规范会引起结果不准确，还需制定详细的操作规程，从而指导检验人员的操作而酵母的活性检测是不够的，需加以适当的酵母活力的检测，特别在酵母使用的关键点。