低温胁迫对转SoTUA基因甘蔗生理生化特性的影响.docx

    低温胁迫对转SoTUA基因甘蔗生理生化特性的影响    唐丽华　黄婵　陈教云　杨丽涛　邢永秀　农友业　李杨瑞Summary：【目的】研究低溫胁迫对转α-微管蛋白（TUA）基因甘蔗生理生化特性的影响，对甘蔗TUA基因（SoTUA）进行功能鉴定，为甘蔗抗寒品种选育提供参考依据方法】通过对pCAMBIA3300载体上的标记基因GFP进行PCR扩增及测序，鉴定转SoTUA基因阳性甘蔗品系从中选择4个转基因品系（L1、L2、L3和L4），以野生型ROC22植株为对照（CK），对各处理进行低温（4 ℃）胁迫处理，在胁迫第0、4、7和12 d时分别测定不同处理甘蔗的生理生化指标结果】运用PCR筛选得到转SoTUA基因T1代甘蔗植株，对其中4个品系及CK的低温胁迫试验结果表明，在低温下各品系可溶性糖含量以不同模式变化，转基因各品系普遍高于CK;各品系中的可溶性蛋白在冷驯化前期强烈诱导，总体变化趋势为先升高后降低，转基因各品系普遍高于CK;各品系中丙二醛（MDA）含量增加，其中CK的增幅最大;过氧化物酶（POD）活性下降，除L2外，POD活性变化总体上呈先升高后降低的变化趋势;脯氨酸含量在低温胁迫过程中的变化趋势无明显规律。

利用改进的极点排序法对各品系抗寒性进行评价，可知各品系抗寒性强弱排序为：L3>L1>L2>L4>CK结论】低温胁迫下4个转SoTUA基因甘蔗品系在生理生化指标上的表现均优于CK，即SoTUA基因在甘蔗体内的过量表达有利于甘蔗抗寒性能的提高Key： 甘蔗;SoTUA基因;生理生化;抗寒性： S566.101                              文献标志码： A ：2095-1191（2019）05-0950-07Abstract：【Objective】This study was conducted to investigate the effects of low temperature stress on physiological and biochemical characteristics of α-tubulin（TUA） transgenic sugarcane，and to identify the function of sugarcane TUA gene（SoTUA）. It provided reference for sugarcane cold-resistant variety breeding. 【Method】SoTU Atransgenic sugarcane lines were identified by PCR amplification and sequencing of GFP marker gene on vector pCAMBIA3300. Four transge-nic lines（L1，L2，L3 and L4） were chosen for a low temperature（4 ℃）stress assay when the wild type of sugarcane variety ROC22 was used as control（CK）. The changes of physiological and biochemical indexes were measured at 0，4，7，12 d after treatment. 【Result】The SoTUA transgenic T1 sugarcane plants were screened by PCR， and the results of low temperature stress assay on four lines and the control showed that the soluble sugar content of each line varied in different patterns at low temperature， and the transgenic lines were generally higher than the CK. Soluble protein of all lines was strongly induced in the early stage of cold treatment， the overall change trend was first increased and then decreased， and the transgenic lines were generally higher than the CK. Malonaldehyde（MDA） content in each line increased， especially in the control. Peroxidase（POD） activity decreased， except for L2， POD activity generally increased and then decreased. The proline content change had no obvious regulations during the low temperature stress. The improved pole ordination me-thod was used for the comprehensive evaluation of cold resistance. The results showed that the cold resistance of all the lines was ranked as L3>L1>L2>L4>CK. 【Conclusion】The physiological and biochemical performances of the four SoTUA transgenic sugarcane lines were better than the CK under low temperature stress. Therefore，it can be concluded that the overexpression of SoTUA gene in sugarcane is conducive to the improvement of cold resistance.Key words： sugarcane; SoTUA gene; physiology and biochemistry; cold resistance0 引言【研究意义】甘蔗是热带和亚热带作物，属喜温、喜光作物（李杨瑞，2010）。

寒害不仅影响甘蔗的地理分布，同时降低甘蔗的蔗糖分和产量，是甘蔗产区的主要气候灾害之一（欧钊荣等，2008）利用传统育种方法提高作物耐寒性收效甚微（Sanghera et al.，2011），而转基因等分子生物技术可为提高甘蔗抗寒性提供有效方法微管是细胞骨架的重要组成成分，在细胞生长及维持细胞形态中发挥重要作用，此外微管与质膜密切相连，被认为是信号感知与转导的主要场所及下游通路的主要靶标（Gilroy and Trewavas，2001;Wasteneys and Galway，2003）已有研究报道了微管对作物抗寒性的直接作用（Pihakaski-Maunsbach and Puhakainen，1995）α-微管蛋白（TUA）是微管的主要成分之一（Farajalla and Gulick，2007）因此，对转TUA基因甘蔗不同品系进行低温胁迫，通过测定其生理生化指标的变化而评价各品系的抗寒性，并对甘蔗TUA基因（SoTUA）进行功能鉴定，可为甘蔗抗寒品种选育提供参考依据前人研究进展】在低温胁迫下，微管在调节及传导信号中扮演重要角色，微管瞬时解聚可触发植物冷驯化，增强植物抗寒性（Abdrakhamanova et al.，2003）。

Kerr和Carter（1990）研究发现，低温胁迫下，微管稳定剂处理可使黑麦抗寒性降低，说明微管瞬时解聚有利于增强植株抗寒性Abdrakhamanova等（2003）选取3种不同抗寒性的小麦品种进行低温胁迫，发现在抗性品种中微管发生瞬时快速解聚并形成冷稳定性微管;敏感性品种未觀察到微管瞬时解聚，当使用除草剂脉冲处理使微管解聚后，则可诱导抗寒性Farajalla和Gulick（2007）在小麦中鉴定出15个TUA家族基因，且发现这些基因的表达量在低温下以不同的模式变化张云（2015）在华南忍冬中克隆得到TUA3基因，将其转入拟南芥中，结果表明，转TUA3拟南芥在高钙胁迫下可维持较高的细胞质浓度本研究切入点】本课题组前期从甘蔗品种GT28叶片中克隆得到SoTUA基因，基因全长1558 bp，编码450个氨基酸，其编码蛋白分子质量为49.6 kD，理论等电点为4.8（张保青，2013）;并通过农杆菌转化法将SoTUA基因转入甘蔗品种ROC22中，通过PCR检测获得转SoTUA基因阳性T0代植株（孙波，2016）对于已获得的转SoTUA基因阳性甘蔗植株，其后代在抗寒方面的功能还有待进一步验证。

拟解决的关键问题】对已获得的转SoTUA基因阳性甘蔗植株后代进行低温胁迫，测定转SoTUA基因甘蔗品系的生理生化指标变化，对转SoTUA基因进行功能验证，为SoTUA基因功能研究及甘蔗抗寒品种选育提供参考依据1 材料与方法1. 1 试验材料试验材料为本课题组获得的T1代转SoTUA基因甘蔗中的4个品系（L1、 L2、L3和L4），对照为野生型ROC22植株（CK）1. 2 试验方法试验于2017年8月在广西大学甘蔗研究所温室大棚内进行甘蔗长至8叶时，选取长势一致的植株，转入人工气候培养室进行4 ℃低温处理，光强为200～300 μmol/m2·s，光周期为12 h，相对湿度为60%～70%低温处理时长为12 d，每个品系每处理重复4次，分别在0、4、7和12 d采集植株+1叶，经液氮冷冻后，保存于-80 ℃冰箱中以备检测，采样时间为早上8：00—9：00低温胁迫天数结合甘蔗植株外部形态变化进行设计，在低温胁迫4和7 d时，观察到对照组甘蔗植株叶片发生不同程度的卷曲，其比例分别为50%和75%（发生卷曲株数/总株数），在12 d时观察到叶脉发生水渍化1. 3 转基因甘蔗鉴定1. 3. 1 转基因甘蔗DNA提取 在甘蔗移栽存活后，采集植株+1叶，去掉叶脉，采用改进的SDS方法提取叶片DNA（邵敏，2015）。

1. 3. 2 PCR检测 根据pCAMBIA3300载体上的标记基因GFP设计1对引物，引物序列为GFPF（5'-GATGGCCCTGTCCTTTTACCA-3'）和GFPR（5'-TT TTCGTTGGGATCTTTCGAA-3'），扩增产物长度为700 bp以提取的转基因甘蔗叶片DNA为模板，进行PCR检测PCR反应体系25.0 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL以pCAMBIA3300-SoTUA-GFP重组质粒作为阳性对照，甘蔗品种ROC22野生型植株为阴性对照，然后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测切胶后使用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对1. 4 测定项目及方法可溶性糖含量采用硫酸蒽酮法测定（李合生，2000）;可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定（李合生，2000）;丙二醛。