放线菌Ｃ３－１１的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究.docx

放线菌Ｃ３－１１的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究 张玲玲　董美玉　许凤春　汪江峰　黄　剑摘要从重庆酉阳山区土样中分离到1株放线菌C3-11，该菌株发酵液对14种病原真菌进行室内生物活性筛选，结果表明，C3-11菌株发酵液对油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的菌丝抑制率都在90%以上，对其余供试病原菌均有不同的抑制作用通过对发酵液稳定性的初步研究，表明该菌株的发酵液对光照、温度及酸性条件作用下都较为稳定关键词放线菌C3-11；抗菌活性；稳定性Q939.96A 1007-5739（2009）03-0109-02从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的生物农药是新农药研究的一个重要方向[1]，放线菌是重要的微生物资源，是产生抗生素的主要来源目前从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中，近70%是由放线菌产生的[2-5]，世界各国对放线菌的研究与资源开发极为重视，其中农用抗生素的筛选和应用已成为研究的重点因此，从放线菌中寻找农用抗活性物质有较为广阔的前景本研究是从我国不同地域采集的土样中，进行广泛地筛选分离，从重庆酉阳山区的土样中分离到1株放线菌C3-11，该菌株对油菜菌核病菌有强烈的抑制作用，同时对其他病菌也有一定的抑制作用，在确定其生物活性后，又对其发酵液的稳定性做了进一步的研究，现总结如下。

1材料与方法1.1材料1.1.1供试土样试验所用土样采自于重庆、河南、云南和贵州等地1.1.2供试病原菌油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、半夏立枯病原菌（Rhizoctonia solani）、水稻纹枯病原菌（Thanatephorus cucumeris）、烟灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、交链孢病菌（Al-ternaria alternata）、莴苣黑斑病菌（Stemphylium chisha）、甘薯黒疤病菌（Ceratocystis fimbriata）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.1.3培养基PDA培养基，牛肉膏蛋白胨培养基；高氏1号合成培养基（可溶性淀粉20g，KH2PO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂20.0g，水1 000mL，pH值7.6~7.8）；液体发酵培养液（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，蛋白胨3.0g，NaCl 2.5g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4用250mL三角瓶分装，每瓶100mL，121C灭菌30 min种子发酵培养基（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，淀粉20.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4）1.2方法1.2.1菌种的筛选将土样自然风干，用研钵磨细，过孔径0.1mm筛，称取研细的土壤5g，加入盛有45mL灭菌水的三角瓶中，充分振荡，制成10-1土壤浓度悬浮液待土粒沉淀后，吸取1.0mL上清液，移入盛有9mL灭菌水的10mL容量瓶中，制成10-2土壤浓度悬浮液依此类推，制成10-3、10-4和10-5土壤浓度悬浮液，吸取上述10-3～10-5土壤浓度悬浮液0.1mL（约2滴），加到高氏1号合成琼脂培养基平板上（加50mg/L重铬酸钾作为抑制剂）进行菌种分离，用灭菌涂布棒涂均。

28℃培养，纯化后转接到斜面保存1.2.2发酵液的制备将保存的菌种划线接种于高氏1号平面培养基上，置于28℃恒温培养箱培养6d将培养好的菌落接入种子发酵培养基中置于恒温摇床上发酵2d，将种子发酵液以10%的接种量接种于小米液体发酵培养基中，28℃发酵6d后过滤，发酵液4℃冰箱中保存备用1.2.3抑菌试验1）菌丝生长速率法[6]将原始菌株发酵液10mL与90mL融化的PDA培养基混匀，倒入无菌培养皿中制成带药培养基平板培养基凝固后，在每个培养基平板上放入1个供试病原真菌菌饼（直径为4mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，每处理重复3次置于28℃恒温箱中培养72～96h后，用“十”字交叉法测量供试病原真菌菌落生长直径，用下式计算抑制率2）管碟法[6]将供试菌与适量培养基充分混匀，倒入9cm培养皿中制成带菌平板，每个平板上放上3个牛津杯（内径0.6cm、外径0.8cm、高1cm的不锈钢杯），每管加入发酵原液0.2mL，以蒸馏水为对照，置于28℃恒温培养箱里培养24h后，采用“十”字交叉法测量抑菌圈直径1.2.4发酵液的稳定性试验[8-9]1）光照条件下的稳定性试验将C3-11的发酵液置于室温光照放置5d、10d、20d、30d、40d、50d、60d，另外取原始发酵液10mL于灭菌过的离心管中，紫外线照射1h。

以油菜菌核病菌为指示菌，用菌丝生长速率法测定抑菌活性根据抑制率的大小来确定其稳定性2）温度条件下的稳定性试验将发酵液于40℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃分别处理1h，以及高温灭菌40min，以未经处理的发酵液为对照，以油菜菌核病菌为指示菌，用菌丝生长速率法测定抑菌活性，每处理重复3次3）酸、碱的稳定性试验将菌株发酵液用1moL/L HCl和1moL/L NaOH分别将pH值调到2、4、6、8、10、12，放置一段时间后再将各发酵液的pH值调回到原始发酵液的pH值7，以油菜菌核病菌为指示菌，用菌丝生长速率法测其抑菌活性的变化，以原始发酵液pH值为7做对照，每处理重复3次2结果与分析2.1抗菌活性菌种的筛选对筛得的200株放线菌做抑制真菌活性试验，计算抑菌率发现了几株抑菌活性较高的放线菌菌株，其中从重庆酉阳山区土样中挑出1株有明显抑制油菜菌核病菌活性的菌株，命名为C3-11做摇瓶发酵培养，进一步做抑菌试验复筛2.2发酵液抑菌生物活性作用结果从表1可以看出，C3-11菌株发酵液对油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制率都在90%以上，对玉米小斑病菌抑制率在85%以上，对其余供试病原菌均有不同的抑制作用。

从表2可以看出，C3-11菌株发酵液对这3种病原细菌的抑菌圈不明显，抑菌圈直径较小，表明此菌种发酵液对这几种病原细菌的抑制效果不明显，但对病原真菌抑制效果明显，尤其对油菜菌核病菌的抑菌效果最好，达到97.8%2.3发酵液对光的稳定性从图1可以看出，C3-11菌株发酵液在室温下放置5d、10d、20d、30d、40d、50d、60d抑菌活性变化不大，放置60d后抑菌活性仅下降了4.7%，但在紫外线下照射1h后抑菌活性下降了11.5%，抗菌活性略有下降说明C3-11菌株发酵液在室温条件下是稳定的，不发生分解及结构上的改变，紫外线照射下活性下降不大，相对稳定2.4发酵液对温度的稳定性由图2可以看出，发酵液在80℃处理的与对照相比变化不大，温度大于90℃时，抗菌活性才下降，大于100℃抗菌活性下降较快，高温灭菌40min后抗菌活性只有49.6%，说明C3-11菌株发酵液在当温度高于100℃抗菌活性则有较为明显的下降但当温度低于80℃时则具有较好的热稳定性2.5发酵液对pH值的稳定性从图3可以看出，C3-11菌株发酵液在pH值为4时抗菌活性为91.3%，与原始发酵液相比下降不大，当pH值为2时，抗菌活性为80.7%，比原始发酵液下降了14.7%，说明C3-11菌株发酵液在弱酸条件下比较稳定，碱性条件处理后活性下降较大，当pH值为12时抗菌活性60.8%，与原始发酵液相比下降较多。

因此，C3-11菌株发酵液的分离纯化和使用过程中应保持在中性或弱酸性环境中为佳3结论与讨论研究表明，从土壤中筛选得到的放线菌C3-11对几种真菌病原菌都有较好的抑制作用，尤其是对油菜菌核病菌的抑制作用最强，达到97.8%，但对病原细菌的抑制作用不明显因此，C3-11可望作为候选菌株以进一步研究其抗菌活性物质本试验还进一步对C3-11菌株发酵液稳定性进行研究，结果表明发酵液对光、温度及酸都有良好的稳定性，对碱的稳定性稍差一些这为菌株发酵液活性成分的分离纯化提供了参考关于该放线菌菌株的鉴定、发酵条件优化及活性成分的分离正在进一步地研究中4参考文献[1] 功能.生物农药发展的机遇与挑战[J].中国生物防治，2001，17（4）：184-185.[2] 阮继生，刘志恒，梁立儒，等.放线菌研究及应用[M].北京：科学出版社，1990.[3] 张一宾.由植物中放线菌产生的植物生理活性物质[J].世界农药，2003， 25（1）：9-12.[4] 安德荣.生物制药的原理及方法——抗生素的制备[M].北京：中国科学文化出版社，2002.[5] 李毅，王国平，张克诚.拮抗放线菌LJ50和MJ52的分离与初步鉴定[J].湖南农业大学学报，2005，31（3）：310-314.[6] 刘晓妹，陈秀蓉，蒲金基.两株芽孢杆菌无菌液抗菌谱及稳定性测定[J].中国生物防治，2003，19（3）：141-143.[7] 龙建友，姬志勤，师宝君，等.一株抗生素产生菌No.24菌株发酵液抗菌谱及稳定性测定研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2004，32（11）：61-64.[8] 赵刚，吴元华.一株链霉菌发酵液的抗菌谱及稳定性[J].农药，2006， 45（8）：525-528.[9] 邵彦坡，方丽萍，魏少鹏，等.海洋放线菌B5菌株发酵液抗菌谱及稳定性研究[J].西北农业学报，2007，16（3）：248-251，256. -全文完-。