生物技术制药：酶工程制药-1.ppt

1,第七章 酶工程制药,2,第一节 概述,一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术3,酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用 1953年，德国人提出了酶固定化技术 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用4,一 、酶的基础知识,（一）酶是生物催化剂 酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂 催化高效性 专一性：结构专一性；立体异构专一性 酶具有不稳定性,5,（二）酶的化学本质 蛋白质,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物辅基,与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物金属激活剂,金属离子作为辅助因子6,二、现代酶工程的主要内容：,1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发； 2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测； 3.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； 4.酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；,7,5.有机相中酶反应的研究； 6.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； 7.抗体酶、核酸酶的研究； 8.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。

8,三、酶的来源,酶的来源：酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离非常少的是合成,基因工程. 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高工业生产一般都以微生物为主要来源目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的9,目前常用的产酶微生物,E.coli ：是应用最广泛的产酶菌分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶 枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶 曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶,10,四、酶在医药领域的应用,1.在疾病诊断方面的应用 由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景 酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:,12,(2)用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：,13,2.在疾病治疗方面的应用-酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为药用酶。

药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛,14,消化类：研究最早，是品种最多的一类酶. 在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等健美生消化酶帮助肠胃蠕动,15,抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种 多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑 其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等16,血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的 凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血 纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等 抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡,17,凝血酶,18,栓溶酶类与心血管疾病,19,解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。

主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等 青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应21,溶菌酶,22,3.在药物生产方面的应用 利用酶的催化作用将前体物质转变为药物这方面的应用日益增多现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的,24,青霉素酰化酶与抗生素改造,25,26,27,28,五、酶类药物的发展,1987年，第一种重组酶类药物Activase（Genentech公司，栓类药tPA）诞生，治疗由冠状动脉阻塞引起的心脏病 AdAgen(腺苷脱氨酶,阿达根)：腺苷脱氨酶缺乏症患者,T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡,从而引起免疫功能缺陷PEG-ADA酵素，可以减少多余腺苷, 1990年被批准用于治疗缺乏腺苷脱氨酶而造成的重症联合免疫缺陷病(SCID) AdAgen是第一种在美国罕用药法案下经FDA批准的酶类药物29,美国罕用药法案(Orphan Drug Act)是1983年为鼓励制药公司研制那些用于治疗少数人所患疾病而制定的法案,(7年的市场独占期,并允许临床研究成本进行税收抵扣) 孤儿药：是用于诊断、预防或治疗致命或非常严重的罕见疾病的药物 Activase和AdAgen的批准，标志着酶类药物新时代的到来，可以补充其他药物的不足。

生物化学反应依赖于催化，酶类药物在血液病、遗传病、灼伤清除,传染性疾病、癌症等治疗方面有广泛的前景30,1 酶类药物治疗遗传性疾病,AdAgen用于治疗SCID，成为第一种成功治疗遗传性疾病的酶类药物 Ceredase(葡糖脑苷脂酶):治疗葡糖脑苷脂酶缺乏病，该病是葡糖神经鞘脂类分解代谢中起作用的葡糖脑苷脂酶功能活性降低引起的在这种酶替代治疗中，酶类药物靶向攻击体内病灶重组技术促进了该酶的批量生产于1994年由FDA批准上市 牛乳糖苷酶缺乏症从酵母菌菌种发酵制备牛乳糖苷酶已应用于临床,31,目前至少治疗3种黏多糖储积病(MPS)的酶替代治疗正在研究中及上市黏多糖储积病是黏多糖代谢的先天性缺陷，均由于缺乏特异性降解性溶菌体酶所致，患者多以黏多糖尿、身材矮小及脂肪软骨营养不良为特征32,Aldurazyme (BioMarin制药公司，玻璃酸酶类药物)，已经成功进行了MPS I的酶替代治疗，2003年上市 亨特病(Hunters disease)属于MPS，是由于缺乏硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶引起的黏多糖代谢的x_连锁的隐性先天性缺陷，用于治疗亨特病的Aryplase (BioMarin制药公司, 重组N-乙酰半乳糖胺4-硫化酶，酰基硫酸酯酶 B,arylsulfatase ),2004年上市 Naglazyme用于粘多糖病第六型，200年上市,33,2 酶类药物治疗消化道疾病,酶类药物可以治疗很多消化性疾病。

利用酶作为消化促进剂，改善胃肠道功能 口服肽酶可以治疗由于摄入一种富含脯氨酸的麦醇溶蛋白引起的营养不良综合征：口炎性腹泻 先天性蔗糖酶一异麦芽糖酶缺陷症(CSID) ，可以利用由酵母中提取出的呋喃果糖苷水解酶，即药酵母蔗糖来进行口服治疗CSID的特点是患者的蔗糖糖酶活性缺乏，异麦芽糖酶活性降低34,苯丙酮酸尿症,体内缺失苯基丙氨酸羟化酶Phenylase (BioMarin, 苯基丙氨酸氨裂解酶,PAL) 可在胃肠道中降解苯基丙氨酸 FDA批准DNA酶(阿法链道酶,Dornase a)用于治疗肺囊性纤维化Dornase可以溶解肺内的黏液,可以通过降低支气管肺泡灌洗中的金属蛋白酶基质来减少肺部组织的破坏 胰腺含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，对营养吸收障碍大有帮助这些酶还可以治疗胰腺功能不全，防止遗传性胰腺病囊性纤维化胰腺酶混合物TheracLEc Total，已经于2002年作为罕用药成功上市35,3 酶类药物治疗损伤组织,细菌和植物中的蛋白水解酶一直用来清除灼伤后的死皮但是所用酶的质量和纯度往往达不到要求，人们渐渐改用它法重组技术的引进大大提高酶的质量和纯度酶类药物又开始进入临床试验 胶原酶清创局部灼伤已经有了令人鼓舞的结果。

软骨素酶用于治疗脊椎损伤，可以促进受伤脊椎的再生软骨素酶除去神经胶质瘢痕中积聚的硫酸软骨素，而后者正是抑制神经轴突生长的元凶 玻璃酸酶也具有水解硫酸软骨素的活性，同时有助于损伤的神经组织的再生36,4 酶类药物治疗传染性疾病,溶解酵素：由于可以破坏细菌细胞壁的糖链，在食品等领域一直用作抗菌剂它还存在RNA酶A和泌尿系统RNA酶U可以选择性地降解病毒RNA，因此还表现出抗HIV活性 几丁质酶：真菌、原生动物、寄生虫等许多致病微生物的细胞壁都含有几丁质，抗菌剂的靶位 溶菌酶：则可以杀死肺炎链球菌、炭疽杆菌、产气荚膜梭菌等，其本身可以治疗感染，而且不会产生新的耐药性菌株37,5 酶类药物治疗癌症,PEG化的精氨酸脱氨酶、精氨酸降解酶等可以抑制人体恶性黑素瘤、肝脏癌细胞的生长，这些癌细胞都是精氨酸营养缺陷型的，缺乏精氨琥珀酸酯合成活性而不能独立生长38,Oncaspar (安龙药业，PEG-aspargase)是一种PEG化天冬酰胺酶，94年批准用于临床治疗急淋 该酶选择性地消耗某些类型瘤组织的营养成分，而正常细胞能自身合成天冬酰胺酶故不受影响正常细胞可以合成天冬酰胺酸，而癌细胞却不能合成，只能依靠天冬酰胺酸降解酶的存在维持生命。

天冬酰胺酶及PEG-天冬酰胺酶辅助化疗都是非常有效的，目前的关键是PEG-天冬酰胺酶的生产成本较高，较难普及39,软骨素酶，除去硫酸软骨素蛋白多糖可以抑制肿瘤的恶性生长 利用化疗方法来治疗癌症的副作用是尿酸过多尿酸氧化酶可以降解难溶性尿酸近几年，有5种利用该酶的酶类药物获得FDA的批准法国Sanofi Synthelabo公司生产的重组尿酸氧化酶，由黄曲霉培养液纯化而得，治疗高尿酸血症疗效较好，其PEG化型酶减轻了免疫反应，提高了半衰期，得到了较好的应用40,世界四大酶制剂公司,1.丹麦诺维信酶制剂公司，全球最大的酶制剂公司公司产品占有中国50%的工业酶制剂市场在天津有生产基地，并在全国都有分厂和合作工厂有75类将近600种不同酶制剂产品,食品饲料为主. 2.世界第二大酶制剂公司美国杰能科genencor,全球市场分额.无锡新工厂,41,3.德国AB酶制剂公司 ,主要产品：果胶酶，果浆酶，纤维素酶，蛋白酶，-淀粉酶，木聚糖酶，-葡聚糖酶，甘露聚糖酶等 4.比利时BELDEM,42,国内现状,无锡市酶制剂厂是第一个专业酶制剂厂,1965 目前全国有100余家生产企业，产量到32万吨，品种20余种，近20年间年产量的平均增长率超过20%。

差距和问题，产品品种少，结构不合理；生产规模小，生产水平低，产品质量差；开发能力差，精细化程度低43,1、细胞破碎 2、酶的提取 3、酶的分离方法 4、酶的组合分离纯化策略 5、酶的浓缩、干燥与结晶,第二节 酶的分离纯化(复习),44,酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等45,第三节 酶和细胞的固定化,（一）固定化酶的制备 1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂制备固定化酶的过程称为酶的固定化固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系46,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,47,2、固定化酶的特点,（1）可以多次。