荧光定量PCR技术在临床检测中得应用.docx

荧光定量PCR技术在临床检测中得应用荧光定量PCR技术在临床检测中的应用九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR发展简史PCR(PolymeraseChainReaction)1983Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR1985关于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在Science上发表198912月Science杂志将PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名为第一个“年度分子” 1993KaryMullis，NobelP 面及掌心、屁股出现小泡传染性极高病程约1周HFMD的病原手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括CoxA5,A10,A16,A19,EV71,以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒,以CoxA16和EV71最为常见传播途径:粪-口途径传播:唾液与粪便;呼吸道传播:空气飞沫;接触传播疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出 HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布,但近年EV71在东南亚一带流行,引起较多的重症和死亡病例 在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以CoxA16为主，2022年，CoxA16和EV71共循环引起手足口病爆发,EV71在大部分省市为优势病毒。

人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径口腔/呼吸道咽喉及下肠胃道传播扁桃体、深层淋巴结、肠道淋巴结微病毒血症先天性感染神经系统心脏肝脏、胰脏、肾上腺呼吸系统皮肤及黏膜病毒血症神经系统抗体产生、病毒血症消失，病毒感染症状改善飞沫、接触、饮食肌肉致病特点隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感 病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染 不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现 感染过程中形成病毒血症 中国HFMD的流行1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例1987年在中国分离到CVA161995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒 2022年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡 实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3和/或CVA16 2022年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起加强HFMD病原检测和监测的十分必要依据台湾1998-2022和中国大陆2022-2022年的经验掌握手足口病病原谱，特别是EV71感染所占的比例，对析判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。

手足口病的实验室检测手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同 通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒 病毒实验室检测类型-病毒实验室诊断方法检测抗体/抗原检测病毒检测核酸ELISA/HI/PA蛋白印迹病毒分离ELISA电镜中和试验RT-PCR实时荧光定量PCR套式PCRLAMP免疫荧光基因芯片每种方法各有优势,依据病毒来定检测策略Newmoleculartoolsforepidemiologystudiesanddiagnosis三结核杆菌与呼吸道病原体检测TB：TuberclebacilliCP：ChlamydiapneumoniaMP：MycoplasmalpneumoniaSARS：severeacuterespiratorysyndromeH1N1甲型流感呼吸道合胞病毒结核杆菌流行现状（1）罗伯特科赫（），德国细菌学家，结核杆菌发现者结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势TB结核杆菌流行现状（2）我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位2000年，全国人口结核感染率为44.5%，其中1544岁人群占了53，每年约有25万人死于结核病结核杆菌引起的感染肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。

肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核 常规结核病实验室诊断方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：阳性率低、费时2.细胞培养“金标准”：周期太长(3-4W)3.血清学诊断：a.接种BCG可出现阳性b.不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人c.交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！TB荧光定量PCR检测TB-DNA的意义1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强2.早期、快速、准确地诊断结核病 痰液、肺及支气管灌洗液肺结核血液播散性结核和各脏器的结核病脑脊液中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病TB3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法 4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降 根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据TB荧光定量PCR检测TB-DNA的意义CP、MP感染可致咽炎、支气管炎和肺炎，潜伏期约2-3周，通常起病较缓慢 持续性咳嗽 肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)感染与致病CP/MPMP肺炎约占非细菌性肺炎的1/3以上，或各种原因引起的肺炎的l0。

MP感染与小儿支气管哮喘密切相关 CP感染与冠心病存在密切的关系肺癌、支气管扩张患者中CP感染率相对较高荧光定量PCR用于非典型性肺炎的诊断意义：1.直接检测病原体，早期、快速、特异诊断非典型性肺炎 2.治疗方案与细菌、病毒感染的治疗方案不同3.流行病学调查 TB、MP、CP已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目MP/CP/SARS甲型H1N1流感流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病 甲型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个亚型(N1-N9) “猪流感”更名为“甲型H1N1流感”世界卫生组织4月30日宣布，从当日起，该组织不再使用“猪流感”一词指代当前疫情，而开始使用“A（H1N1）型流感”一词 与之相对应，我国的官方文件从5月1日起相继用“甲型H1N1流感”代替原来的“人感染猪流感” 世界卫生组织发言人说，之所以更改叫法，是因为“猪流感”一词容易误导消费者，美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响。

世界卫生组织的声明说，根据目前掌握的科学依据，此次流行的病毒仅在人际间传播，尚无证据表明它在猪群内传播，或由猪向人传播，也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病 病原学甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm120nm，有囊膜 囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白 病毒颗粒内为核衣壳,呈螺旋状对称,直径为10nm 甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成 流行病学特点传染源主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒 感染这种病毒的动物均可传播 传播途径主要为呼吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播 某些毒株如H1N1可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等 易感人群普遍易感 患者多数年龄在25岁至45岁之间，目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童 临床表现潜伏期一般1至7天左右，较流感、禽流感潜伏期长。

人感染甲型H1N1流感后的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等 部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过39，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡 实验室检查1.外周血象：白细胞总数一般不高或降低 重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；2.血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；3.反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等；4病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离甲型H1N1流感病毒 常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法 现有的诊断方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要2-3周时间 人感染猪流感的诊断标准1.医学观察病例：曾到过甲型H1N1流感疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史，1周内出现流感临床表现者。

列为医学观察病例者，对其进行7天医学观察（根据病情可以居家或医院隔离） 2疑似病例：曾到过疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史（也可流行病学史不详），1周内出现流感临床表现，呼吸道分泌物、咽试子、痰液、血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性 3.临床诊断病例：被诊断为疑似病例，且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者 4.确诊病例：从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；RT-PCR对上述标本检测，有甲型H1N1病毒RNA存在，经过测序证实，或两次血清抗体滴度4倍升高，可确诊为人感染甲型H1N1流感 四TORCH感染特点与检测TOX:ToxoplasmagondiiRV:RubellavirusCMV:HumancytomegalovirusHSV:HerpessimplexvirusTORCHTORCH感染特点1.母-胎传播的主要病原体2.引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3.自然状态下呈隐性感染4.怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染5.可致多发性、全身性感染6.只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防TORCH(一)弓形虫感染与致病滋养体如弓形，广泛分布，人兽共患。

寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主易感者多，免疫者少我国智力低下儿的弓形虫感染率28畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12.25艾滋病患者约有2080合并弓形虫感染，造成艾滋病死亡的一个重要并发病TORCHTOX人群自然感染率达到60-90%，多为隐性感染免疫功能低下(怀孕、多次输血、器官移植、AIDS)发生显性感染可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一围生期感染血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒(二)人巨细胞病毒感染与致病TORCH-CMV风疹是一种世界性的病毒传染病，是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一出疹前1周至出疹后5天均有传染性人是风疹病毒的唯一宿主风疹感染后可获得持久的免疫力。