核因子κB在胰腺癌中的表达及与VEGF和p53表达的相关性.doc

1核因子 κB 在胰腺癌中的表达及与 VEGF 和 p53 表达的相关性【摘要 】 目的 探讨核因子 κB (NF κB,p65)在胰腺癌组织中的表达及其与 VEGF、p53 蛋白表达的相互关系方法 电泳迁移率变动分析 (EMSA)测定 45 例胰腺癌及癌旁组织、8 例慢性胰腺炎和 9例正常胰腺组织中 NF κB 的活性,Western 印迹法检测NF κB、IκB  a 蛋白表达; 免疫组织化学法检测胰腺癌中VEGF、p53、p65 蛋白表达结果 NF κB 在肿瘤组织中被激活；NF κB 在胰腺癌、旁组织、慢性胰腺炎、正常胰腺组织中阳性表达率分别为 71.0%、20.0%、12.5%、0(P<0.05) ；NF κB 基因表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关(P>0.05)，与淋巴结转移和周围浸润有相关性(P<0.05)；转移癌中 NF κB 蛋白表达与 VEGF、p53 蛋白表达显著相关结论 核因子 κB 基因在胰腺癌中过度表达并与 VEGF、p53 一起参与胰腺癌的浸润、转移过程 【关键词】 胰腺癌 核因子 κB 抑制性 κBa 血管内皮生长因子 蛋白质 p530 引 言2最近研究发现，肿瘤细胞浸润转移能力的改变是通过核因子 κB对其他因子的调节作用实现的，但具体的作用机制还不清楚。

本文拟研究核因子 κB 在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌生物行为的关系以及核因子 κB 表达与 VEGF、p53 表达的相关性，为肿瘤的基因治疗提供理论依据1 材料和方法1.1 材料收集苏州大学第一附属医院普通外科 2000 年 4 月～2005 年 5月期间病理诊断均为导管腺癌的 45 例胰腺癌石蜡标本（临床资料完整）及其 45 例癌旁组织 (距癌灶边缘 1.5～2.0cm， 33 例呈Ⅰ/Ⅱ级不典型增生表现，4 例呈原位癌改变， 5 例有炎性变化，3例有癌细胞浸润)其中男 25 例，女 20 例，年龄 36～70 岁，中位数 55 岁；肿瘤直径＜4cm 者 21 例，≥4cm 者 24 例；高分化 13例, 中分化 14 例,低分化 18 例；根据 TNM 分期（1997 恶性肿瘤国际临床病期分类）标准：Ⅰ期 11 例、Ⅱ期 9 例、Ⅲ期 13 例、Ⅳ期 12 例；伴有区域或远处淋巴结转移和周围浸润者 30 例，其中远处转移者 18 例（肝转移、腹膜和网膜种植等）无淋巴结转移和周围浸润者 15 例8 例慢性胰腺炎和 9 例正常胰腺组织新鲜标本，取3自壶腹癌和胰腺内分泌肿瘤的病人所有标本在术后立即放入-70℃冰箱备用，所有病人均为第一次手术,术前未经任何放化疗。

1.2 主要试剂鼠抗人 p65 单抗、鼠抗人 IκB a 多抗、鼠抗人 p53 单抗（突变型） 、鼠抗人 VEGF 单抗，免疫组化染色（SP）试剂盒均购自北京中山生物技术公司， γ 32ATP 标记的双链寡核苷酸探针：5、 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 33、 TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG 51.3 方法1.3.1 Western blot 分析 提取细胞核蛋白 [1]，采用 Lowry 法准确测定浓度蛋白质样品上样量每泳道为 100μg，用 10%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到 Hybond 硝酸纤维素膜上（美国 Bio Rad 公司） 1.3.2 电泳迁移率变动分析 细胞核的制备、核提取液蛋白含量的测定和反应条件参考文献[1]41.3.3 免疫组化 操作方法按照试剂盒进行， p53、VEGF、p65表达的判断按照文献方法［2,3 ］ 1.3.4 统计学方法 采用医学统计软件 SPSS10.0,χ2 检验, Spearman 相关分析2 结果2.1 Western 检测 NF κB、IκB a 的表达 p65 在肿瘤组织的灰度值高于癌旁组织，IκB a 在肿瘤组织的灰度值低于癌旁组织， （正常胰腺和慢性胰腺炎组织偶见表达） ，说明肿瘤组织中 p65 激活，而 IκB a 失活见图 1、表 1。

1：肿瘤组织；2：肿瘤旁组织； 3：正常胰腺组织； 4：慢性胰腺炎组织图 1 Western 印迹分析 p65、IκB a 的表达2.2 EMSA 检测 NF κB 的活性胰腺癌组织中可见明显的条带,癌旁组织少量条带，慢性胰腺炎和正常胰腺组织未见条带，提示肿瘤组织 NF κB 结合活性提高，5见图 22.3 免疫组化法检测 VEGF、p53 、p65 蛋白表达 p65 在肿瘤组织的检出率 71%(32/45),高于癌旁组织 20%(9/45） ，P<0.01；p53、VEGF 在胰腺癌组织中的阳性表达分别为57.8%（26/45） 、64.4%（29/45） ，分别高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05 ） ，VEGF 阳性染色位于细胞质，阳性细胞分布在血管周围，见图 31：正常胰腺组织；2：慢性胰腺炎组织； 3：肿瘤旁组织；4：肿瘤组织图 2 NF κB 在不同组织中的活性检测2.4 胰腺癌的临床病理特征与 p65 蛋白表达的关系 p65 蛋白表达与胰腺癌的分化程度、临床分期，肿瘤大小无关(P>0.05)；但p65 蛋白在浸润转移组的表达率高于非浸润转移组（P<0.01 ） ，远处转移组高于非远处转移组（P<0.05） ，见表 1。

表 1 胰腺癌的临床病理特征与 p65 蛋白表达2.5 胰腺癌组织 p65 蛋白表达与 VEGF、p53 蛋白表达的相关性分析 VEGF 在浸润转移组和远处淋巴结转移组的阳性表达率分别为670%（21/30）和 88.9%(16/18); p53 在浸润转移组和远处转移组的阳性表达率分别为 66.7%（20/30）和 83.33%(15/18)在浸润转移和远处淋巴结转移组中的 VEGF 阳性表达组中，VEGF 和 p53的阳性表达符合率为 61.9%（13/21）和 75.0%（12/16） 30 例浸润和淋巴结转移组胰腺癌组织中，p65 阳性表达 27 例，VEGF 在这 27 例中阳性表达 19 例，两者符合率为 70.4%（19/27 ） 但在17 例 p65 阳性表达的远处转移组中，VEGF 阳性表达 14 例，两者符合率为 82.4%（14/17） 同样，在转移组和远处转移组中，p53和 p65 的表达符合率分别为 59.3%（16/27）和 82.4%（14/17 ） 3 讨论核因子 κB（NF κB 、p50/p65）是近年来发现的一种转录因子，其表达水平与某些肿瘤的浸润、粘附、转移行为密切相关。

近年来发现，核因子 κB 引起肿瘤细胞浸润、粘附、转移的原因是由于核因子 κB 激活后导致许多粘附分子、血管生长因子、基质蛋白酶的瀑布样释放我们发现 [4,5]，核因子 κB 在肝癌中高表达，并且表达越高，转移率越高；细胞系研究揭示[6]，核因子 κB 与肝癌转移的关系通过 MMP 9 实现；前列腺癌和膀胱癌的研究中发现 [7,8]，核因子 κB 与肿瘤转移的关系分别通过 MMP 9 、VEGF 和 IL 8实现；胰腺癌细胞系研究提示[9]，核因子 κB 与胰腺癌细胞转移行为有关，VEGF、IL 8 参与了这个过程7本研究发现，胰腺癌组织中 NF KB 被活化， p65 蛋白在癌组织表达明显增高，表明 NF κB 激活在胰腺癌的发生发展中有重要作用本研究还发现，p65 蛋白表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关，但与与肿瘤周围浸润和淋巴结转移有关：p65蛋白表达在浸润和淋巴结转移组高于非浸润和转移组，远处转移组高于非远处转移组，说明核因子 κB 参与了胰腺癌的浸润转移过程VEGF 是最重要的促进血管生成的因子有研究发现[10,11] ，胰腺癌细胞 VEGF 基因的表达受 NF κB 基因调控，因为 NF κB 激活或阻滞后，VEGF 表达和血管生成发生变化，肿瘤细胞的转移能力发生改变，肺癌细胞系的研究也得到了相同的结果[12]。

在本试验中，VEGF 在胰腺癌组织中高表达，且 VEGF 表达水平与胰腺癌淋巴结转移和远处转移有关，VEGF 基因表达的改变可能与上述机理有关VEGF 受多种因素调节，近年来研究表明，野生型 p53 下调VEGF 表达，而突变型失去这种功能[13]，本研究中突变型 p53 蛋白在胰腺癌中高表达(57.8%)，且 p53、VEGF 有很高的阳性表达符合率，突变型 p53 蛋白可能参与 VEGF 表达的调控，从而间接参与胰腺癌血管生成8NF κB 和野生型 p53 基因表达是相互协调的[14]在肿瘤组织中突变型 p53 废除了野生型 p53 的作用，当 NF κB 激活后，野生型 p53 诱导细胞凋亡的作用丧失，对 NF κB 的抑制作用丧失在本研究中，NF κB 表达增加可能与 p53 突变和野生型 p53 抑制作用下降有关比较 NF κB、p53 、VEGF 表达的相关性发现，在转移组或远处转移组中，NF κB 表达与 p53、VEGF 表达的符合率在 80%左右，表明 NF κB、p53、VEGF 表达是相互联系的，它们在胰腺癌的浸润转移过程中共同发挥了作用，因此 NF κB 是胰腺癌基因治疗的靶点。

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