三种甘蓝雄性不育类型花粉发育的细胞学观察毕业论文.doc

. . . 首都师大学本科毕业论文三种甘蓝雄性不育类型花粉发育的细胞学观察Cytological analysis of microsporogenesis in three kinds of cabbage male sterility / 中文摘要 本实验利用光学显微和电子显微镜在细胞水平和亚细胞水平对三种我国研究和利用较多的甘蓝雄性不育类型进行了较为系统全面的雄性败育特征和时期分析实验结果表明，隐性核不育类型主要败育时期为减数分裂期，主要败育特征为花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞异常且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后不能形成正常花粉壁，并迅速败育; 萝卜胞质不育类型萝卜胞质不育主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行性加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁；显性核不育主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放，但花粉壁能正常沉积孢粉素，包裹在四分体外的胼胝质降解延迟，而花粉母细胞壁直到花粉成熟仍不能降解。

关键字：甘蓝 (Brassica oleracea)，雄性不育，细胞学观察，小孢子发育AbstractThe microsporogenesis of three kinds of male sterility in Brassica oleracea Var. capitata were investigated by using light microscope(LM) and transmission electron microscope(TEM). Study here suggested that the first sign of significant phenotype of Ms-cr1 was abnormally developed tapetum and middle layer cells at the stage of meiosis. Free microspores did not form exine and degenerate soon after releasing from tetrads. In the Ogu CMS, the microspore disruption was closely correlated with occurrence of tapetal abnormal. After the completion of meiosis, the tapetum cells showed an abnormal increase in size and the released microspore with normal exine were squashed and degenerated soon.The development of microspores in Ms-cd1 was comparable to fertile plants up to the time of tetrad formation. After the completion of tetrads stage, the separation of microspores from each tetrad in the mutant was arrested .The microspores with developing bacula and tectum in Ms-cd1 still adhered together. The callosic wall of the mutant around the microspores degenerated much slower than that of wild type. The pollen mother cell wall surrounding the developing microspores in Ms-cd1 remained un-degenerated till very late pollen stage. Keywords:cabbage(Brassica oleracea)，male sterility，cytological observation， microsporogenesis目录0引言11 材料与方法11.1 实验材料11.2 实验方法21.2.1光学半薄切片制备和观察21.2.2透射电镜样品制备和观察32 结果与分析32.1 可育花药与小孢子发育32.2 隐性核不育花药与小孢子发育过程42.3 萝卜胞质不育花药与小孢子发育过程52.4 显性核不育花药与小孢子发育过程53 讨论63.1 三种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较63.2 药壁组织与小孢子的协调作用74 小结7附录（一）8图1 正常可育花药发育过程光学显微观察8图2 正常可育花药发育电镜观察9图3 隐性不育花药发育过程光学显微观察11图4 隐性不育花药发育电镜观察12图5 Ogu萝卜胞质不育花药发育过程光学显微观察14图6 Ogu萝卜胞质不育花药发育电镜观察15图7 显性不育花药发育过程光学显微观察16图8 显性不育花药发育电镜观察18图9 甘蓝可育花药的发育过程19附录（二）20参考文献21致220引言甘蓝是世界上普遍种植的一种芸苔属蔬菜作物，具有很强的杂种优势。

植物雄性不育是杂种优势利用的基础，现在利用雄性不育进行杂交制种已成为许多作物育种的主要方向和目标，并在生产上取得了很成功，世界各国已广泛应用雄性不育系进行F1杂交新品种的选育，如我国杂交水稻种植面积占水稻总面积的46%-55%，其产量较常规品种增产20%-30%阐明植物雄性不育形成的分子机理，不仅是花粉发育分子生物学的一个重要课题，也是人工控制植物育性的基础确定育性基因在花药发育过程中的表达时期将为阐明植物育性机制和创造新型雄性不育材料提供重要依据，大量的研究工作者在力图搞清植物花粉发育的分子模式,以便更好地研究和控制植物的生殖规律目前国研究较多的甘蓝雄性不育类型有四种，分别是黑芥胞质NiCMS,　隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS,　显性不育MS-cd1研究不同甘蓝雄性不育的花药发育特征不仅可为促进四种不育类型材料在遗传育种上的应用提供参考，同时也可为准确地确定甘蓝小孢子正常发育过程中不同时期育性相关基因的表达，阐明甘蓝雄性不育形成机制提供理论依据中国农科院蔬菜花卉研究所最早对甘蓝的四种不同雄性不育性状的花药发育进行了细胞学初步研究卞春松通过石腊切片光学显微观察[4]，初步证实不同甘蓝雄性不育具有不同细胞学发育过程的终止点。

玉梅对显性不育材料通过电子显微镜观察证实其败育高峰在花粉母细胞至小孢子单核期[6]，主要特征是四分小孢子不能分开但在超微结构上对其它雄性不育类型进一步探讨败育机理的分析尚未见报道本研究通过树脂超薄切片光学观察和电子显微镜观察结合，对其中的三种（隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS,显性不育MS-cd1）雄性不育类型花药败育特征在细胞水平和亚细胞水平进行深入细致的研究，阐明甘蓝雄性不育的花药败育分子机理提供形态学证据1 材料与方法1.1 实验材料以中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组经多代回交获得的三种甘蓝雄性不育类型与作为对照的对应的可育回交亲本共4种材料为试材（见表2.1），2005年春天植株开花后取每一个株系的完整花序，根据可育花蕾大小与花药发育时期的相关性，按照花蕾的着生顺序，从下往上(花蕾由大到小)进行分级，将4种材料的不同发育时期的花药剥离出来并迅速沉入2.5%戊二醛（配方见附录二）中，室温下固定8小时 试材代号雄性不育类型雄性不育来源对应可育材料代号376隐性不育 Ms-cr183121ms530592萝卜胞质不育Ogu CMSCMSR3530680显性不育Ms-cd179－399530表2.1　　三种甘蓝雄性不育材料的来源1.2 实验方法1.2.1光学半薄切片制备和观察1.2.1.1清洗固定后的材料在室温下用PH=7.0、浓度为0.2M磷酸缓冲液(PBS)（配方见附录二）清洗3—4次，每次约2小时。

1.2.1.2脱水清洗后进行脱水，本试验先采用酒精，一般浓度依次为 30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4℃冰箱中进行，每次15分钟，再一次100%的酒精脱水室温20分钟接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行1.2.1.3渗透 实验中用国产环氧树脂618（配方见附录二）作为包埋剂,配方见附录脱水完毕后，用包埋剂：丙酮以2：1的比例配制混合浸透液，在35℃的温箱中浸透2小时之后用纯包埋剂在35℃的温箱中浸透过夜1.2.1.4包埋与聚合将渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，起始温度为 40℃，终了温度大约为60℃，大约每12小时调高3－4℃，使其逐渐聚合1.2.1.5修块包埋块的修整首先用单面刀粗修，然后再用双面刀细修包埋块的顶面修成梯形或长方形，顶面的上下两边要平行，块的顶端修成金字塔形，金字塔的斜面应以45度坡面为宜最后将样品露出，以便切片1.2.1.6切片与染色包埋块在LEICA ULTRACUT R切片机上用玻璃刀切成半薄切片，切片的面积3 mm2左右，厚度大约3000nm左右，挑切片于滴有蒸馏水的载玻片上，在酒精灯上展片，直至水干，切片粘在载玻片上。

在片子上滴上1℅的龙胆紫染料(或结晶紫)（配方见附录二），染四到五分钟，用蒸馏水将多余染液冲掉将经过染色的片子用清水清洗后，盖上盖玻片，用LEICA全自动显微镜镜检并选取清晰的雄蕊精细结构用Nikon Coolpix4200 (Japan)数码照相机照相1.2.2透射电镜样品制备和观察1.2.2.1清洗用2.5%戊二醛固定后的试验材料，用浓度为0.2M，PH=7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗，冲洗2小时，中间换4次缓冲液 1.2.2.2脱水和置换清洗后进行脱水，本试验是先采用酒精脱水,一般的浓度依次为 30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4℃冰箱中进行，每次15分钟，再一次纯酒精室温脱水20分钟接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行1.2.2.3渗透和聚合 实验中用国产环氧树脂618作为包埋剂，置换后的试材用包埋剂和丙酮混合浸透液(2：1)，在35℃温箱中浸透2小时后用纯包埋剂在35℃温箱中浸透过夜渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，40℃加热聚合12小时后逐渐调高温度至硬化后调至60℃直至聚合（大约每12小时调高3－4℃）1.2.2.4切片与染色包埋块在LKB8800III型超薄切片机上，用玻璃刀进行超薄切片，用铜网捞片后用醋酸铀和硝酸铅（配方见附录二）染色后，在日立H-7500透射电镜下进行观察照相。

2 结果与分析2.1 可育花药与小孢子发育甘蓝可育花药的发育过程相对简单（图9），正常可育雄蕊原基上分化出花药原基，花药原基细胞不均衡分裂形成四裂瓣状，进一步发育形成花药的4个小孢子囊，药壁组织平周分裂。